ما هي تقنية ثلاثية الألوان

تقنية ثلاثية الألوان (Trichrome stain): هي تقنية مخبرية يتم فيها استخدام ثلاثة ألوان أساسية لعملية التلطيخ وهي الأحمر والأصفر أو البرتقالي والأخضر أو الأزرق لهذا يطلق عليها بثلاثية الألوان، وتستخدم لتلطيخ العينات النسيجية.

مكونات تقنية التلطيخ بثلاثية الألوان

تتكون تقنية ثلاثية الألوان من ثلاثة أصباغ لونية يتم استخدامها في عملية التلطيخ، وهي: 

• اللون الأحمر: ويتم استخدام صبغة حمض الفوشسين (Acid fuchsin)، أو الزيليدين بونسو (xylidine ponceau)، أو الكروموتروب تو أر (chromotrope 2R)، أو البيبريتش القرمزي (Biebrich scarlet)، أو البونسو سكس أر (ponceau 6R)، أو الفلوكسين(phloxine).

• اللون الأزرق أو الأخضر: ويتم استخدام الأخضر الفاتح مائل للصفرة أس أف (Light green SF yellowish)، أو الأخضر السريع أف سي أف (Fast Green FCF)،  أو الميثلين الازرق (methyl blue)، أو الأزرق المائي (water blue).

• اللون الأصفر أو البرتقالي: ويتم استخدام حمض البكريك (Picric acid)، أو البرتقالي جي (orange G)، أو الأصفر المارتيوس (Martius yellow)، أو التارترازين (tartrazine)، أو الطحين الأصفر (milling yellow).

خصائص تقنية ثلاثية الألوان

تمتلك تقنية ثلاثة الألوان العديد من الخصائص التي تميزها عن غيرها، وهذه الخصائص:

• تعتبر طريقة هامة وتسمى ثلاثية الألوان أو ثلاثية الترايكروم.

• يتم استخدام فيها ثلاثة ألوان من الصبغات، ويتم استخدام  صبغتين حمضيتين أو أكثر  مع استخدام عدة أحماض.

• يتم استخدامها في العينات النسيجية، لزيادة تباين الميزات المجهرية في الخلايا والأنسجة، مما يسهل النظر إليها تحت المجهر.

• تلون هذه التقنية نسيج العضلات باللون الأحمر، وألياف الكولاجين باللون الأخضر أو ​​الأزرق.

أهمية تقنية ثلاثية الألوان

تكمن أهمية تقنية الألوان الثلاث أو ثلاثية الألوان:

• تُميز  هذه الطريقة العضلات عن الكولاجين، وخلايا ألفا النخامية عن خلايا بيتا، والفيبرين عن  الكولاجين، والميتوكوندريا في الخلايا.

• تساعد هذه الصبغة في تحديد  التغيرات في الأنسجة مثل تليف الكبد وتمييز الأورام الناتجة عن خلايا العضلات والأورام الليفية.

• تساعد هذه الصبغة على تقدير كمية الكولاجين، لأنها تقوم بتلوين ألياف الكولاجين الدقيقة بين خلايا الكبد عندما يتم تلطيخ خزعات الكبد.

• يتم استخدام صبغة ثلاثة الألوان لتشخيص الطفيلياتكالأوليات والديدان.

آلية إجراء تقنية التلطيخ ثلاثة الألوان

تكون آلية إجراء تقنية التلطيخ بثلاثي الألوان بشكل عام على النحو الآتي:

• تقوم آلية تقنية ثلاثية الألوان على استخدام صبغتين حمضيتين أو أكثر.

• تقوم هذه الأصباغ الحمضية بتلطيخ البروتينات الأساسية من خلال تطبيقها على العينة بالتتابع، ويمكن التلاعب بدرجة اللون أو نمطه.

• يتم استخدام عديد الأحماض أو البولي أسيد (Polyacid) لإزالة الصبغة مثل حمض الفوسفوموليبديك (phosphomolybdic acid) وهو مادة صلبة صفراء، أو حمض التنجستوفوسفوريك ( tungstophosphoric acid) ، وذلك لأن هذه الأحماض لها وزن جزيئي مرتفع فتزيل الصبغة بسهولة من الكولاجين.

• يتم بعد ذلك تطبيق صبغة حمراء في حمض الأسيتيك المخفف لتجاوز جميع المكونات، ثم يتم وضع بولي أسيد لإزالة الصبغة الحمراء من الكولاجين وبعض المكونات الأخرى.

• يتم بعد ذلك تطبيق صبغة حمضية ثانية تكون زرقاء أو خضراء في حمض الأسيتيك المخفف (dilute acetic acid )، وهذه الصبغة تقوم بإزاحة البولي أسيد أو متعدد الحمض، مما ينتج عنه تلون الكولاجين بلون مغاير للصبغة الأولية المستخدمة.

• إذا تم تلطيخ خلايا الدم الحمراء، فإنه يتم تطبيق صبغة صفراء أو برتقالية ذات وزن جزيئي صغير قبل تلطيخ الصبغة الحمراء، ويتم تطبيقه عادة من محلول مشبع بالإيثانول بنسبة 80٪ مع صبغة حمض البيكريك وتعدد الأحماض.

• تسمى البقع الملطخة التي يتم فيها تطبيق الأصباغ بثلاثية الألوان، ويسمى متعدد الأحماض أو البولي أسيد بتسلسل ثلاثي الألوان متعدد الخطوات.

•  يمكن دمج جميع الأصباغ  مع أو بدون متعدد الأحماض في محلول واحد.

أهم الطرق للتلطيخ بتقنية ثلاثية الألوان

يوجد العديد من الطرق المستخدمة للتلطيخ بتقنية ثلاثية الألوان، وهي:

• طريقة ماسون ثلاثية الألوان (Masson’s trichrome method): وهي عبارة عن طريقة تتضمن بروتوكول وخطوات طويلة لتلطيخ الخلايا والأنسجة الضامة وتمييزها عن بعضها، ويتم فيها تطبيق ثلاثي الألوان عن طريق غمر العينة المثبتة في الهيماتوكسيلين الحديدي، ثم  يتم وضعها في ثلاثة محاليل مختلفة تسمى A و B و C، فمحلول A يسمى صبغة البلازما ويحتوي على عدة أصباغ حمراء، ومحلول B وهو عبارة عن متعدد الأحماض في الماء المقطر ، ومحلول C ويسمى صبغة الألياف ويمكن استخدام أصباغ صفراء أو زرقاء أو خضراء، وتعطي هذه الأصباغ الكيراتين اللون الأحمر وألياف العضلات والكولاجين اللون الأزرق أو الأخضر والعظام والسيتوبلازم اللون الأحمر الفاتح أو الوردي والبني الداكن ونوى الخلايا اللون الأسود.

•  طريقة فان جيسون (van Gieson’s method): هي طريقة من أقدم الطرق أحادية الخطوة للتلطيخ بطريقة ثلاثي الألوان، والتي تلطخ العضلات والسيتوبلازم باللون الأصفر والكولاجين باللون الأحمر.

• طريقة حل الأصفر في الخلية (yellowsolve method): إن الاسم (yellowsolve) هو مزيج من المصطلحين الأصفر (Yellow) وإذابة في الخلية (cellosolve)، ويتم فيها تطبيق صبغة حمراء في حمض الأسيتيك المخفف، ثم يتم تجفيف العينة لضمان عدم وجود رطوبة، ثم يتم بعد ذلك إزاحة الصبغة الحمراء بواسطة صبغة صفراء في مذيب، مثل محلول الخلية 2-إيثوكسي-إيثانول.