استخلاص البروتينات من الاغشية الخلوية

استخراج بروتين جدار الخلية:

البروتينات هي اللبنات الأساسية للخلايا وهي الجزيئات الحيوية الأكثر وفرة وتنوعًا، حيث أن البروتينات مسؤولة حرفياً عن جميع الجوانب الوظيفية للخلية تقريبًا من صنع الغشاء الخلوي إلى تحفيز التفاعل البيولوجي، ووفقًا لقاعدة البيانات يحتوي ما يقرب من 20-30 ٪ من إجمالي البروتينات المشفرة على بروتينات غشائية متكاملة بينما يشتمل جزء 10-20 ٪ على بروتينات مرتبطة بالغشاء.

تشمل هذه المجموعة المتنوعة من البروتينات محولات الإشارة والناقلات والقنوات الغشائية ومستقبلات سطح الخلية، حيث أصبحت هذه المجموعة المتخصصة من البروتينات هدفًا لتطوير الأدوية العلاجية في العقود القليلة الماضية ومع ذلك، نظرًا لعدم توفر التفاصيل الهيكلية الكاملة لهذه البروتينات يكون الاستهداف صعبًا بعض الشيء، مما يجعل تصميم الأدوية أكثر تعقيدًا من المتوقع، والنهج الصحيح هو تصميم طرق مصقولة يمكن أن تساعد في استخراج بروتينات الغشاء وتحليلها.

تنقية البروتينات الغشائية ليست إجراءً أوليًا مثل عملية استخراج البروتين الخلوي، حيث أن الخطوة الأولى دقيقة للغاية وغامضة وتتطلب تعطيل طبقة الفسفوليبيد الثنائية دون الإضرار ببنية البروتين، والعامل الأكثر شيوعًا المستخدم لتلبية هذه التوقعات هو الجزيئات البرمائية مثل المنظفات التي يمكنها بسهولة تكرار الهيكلية.

استبدال جزيئات الفسفوليبيد الطبيعية، منذ أن تم تطوير طرق الاستخراج تم استخدام عدة فئات من المنظفات لتحسين طريقة الاستخراج الأكثر كفاءة لذلك، يصبح فحص المنظفات خطوة أساسية لتطوير بروتوكولات استخراج البروتين الغشائي ومع ذلك بصرف النظر عن بعض المواد الخافضة للتوتر السطحي أو المنظفات لا توجد إرشادات محددة يمكن أن تشير إلى المنظف الأكثر ملاءمة لفئة من بروتينات الغشاء، حيث يجب تحسين البروتوكول وفقًا للحاجة التجريبية.

تقدم (Creative Proteomics) خدمات عزل جدار الخلية وتنقية بروتين جدار الخلية للخلايا النباتية والفطريات والبكتيريا، إذ يمكن أن تساعد هذه الخدمة في الحصول على جدار الخلية المنقى وبروتينات جدار الخلية لإجراء فحوصات لاحقة، حيث أن جدار الخلية عبارة عن هيكل خاص موجود حول الخلايا النباتية، وعدد قليل من الكائنات الحية الأخرى، بما في ذلك الفطريات والبكتيريا وما إلى ذلك.

المكون الرئيسي لجدران الخلايا النباتية هو الكربوهيدرات الهيكلية، السليلوز، بينما تتكون جدران الخلايا الأخرى بشكل أساسي من البروتينات والكيتين والسكريات وما إلى ذلك، كما تحمي جدران الخلايا وتحافظ على شكل الخلايا، بالنسبة للخلايا النباتية يمكن أن تشكل جدران الخلايا جسورًا هيوليًا للسماح بالتداول الحر للسوائل بين الخلايا المجاورة، وفي البكتيريا تعمل جدران الخلايا كسوط وشعيرة، مما يساعد في الحركة وتبادل المواد الجينية على التوالي.

علاوة على ذلك تلعب بروتينات جدار الخلية دورًا مهمًا في الالتصاق والإمراض والاستضداد والتشكل وما إلى ذلك، ومن ثم فإن عزل جدار الخلية وبروتين جدار الخلية هو الخطوة الأولى والضرورية للتحقيق بشكل أفضل في المكونات المختلفة لجدران الخلية والوظائف والتفاعلات بين الخلايا الخلوية والتفاعلات بين جدار الخلية والمصفوفة خارج الخلية إلخ.

مزايا خدمات عزل جدار الخلية وتنقية بروتين جدار الخلية:

في تجربة غنية في فصل وتنقية جدار الخلية، يتم الحصول على جدار خلوي نقي مع شوائب منخفضة دون فقد مكونات جدار الخلية، إذ يمكن عزل جدار الخلية وتنقيته من الخلايا النباتية والفطريات والبكتيريا، كما يمكن استخلاص البروتين من جدار الخلية دون تلوث البروتينات داخل الخلايا والأيضات أثناء العزل، يمكن أن نجري اختبارات التحقق من النقاء للتأكد من وصول البروتين المعزول إلى النقاء المستهدف وإلا فلن تكون هناك أية رسوم.

طرق عزل جدار الخلية وخدمة استخراج بروتين جدار الخلية:

 عضية واحدة – فصل وتنقية جدار الخلية:

يتكون جدار الخلية النباتية من ما يصل إلى ثلاث طبقات، بما في ذلك الصفيحة الوسطى وجدار الخلية الأساسي وجدار الخلية الثانوي، حيث توجد الطبقتان السابقتان في جميع الخلايا النباتية ولكن لا تحتوي جميع الخلايا النباتية على جدار خلوي ثانوي، كما يتكون جدار الخلية الأساسي من السكريات والبروتينات ويتكون جدار الخلية الثانوي من عديد السكاريد واللجنين.

لذلك فإن جدار الخلية هو المكون الأكثر كثافة للخلية ويمكن فصله بسهولة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة، حتى جدران الخلايا تختلف البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام أو الفطريات عن تلك الموجودة في الخلايا النباتية، حيث يمكن فصل جميع جدران الخلايا بسهولة عن المكونات العصارية والغشائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي بسرعة منخفضة نسبيًا بعد تجانس الخلايا، حيث تحدد متطلبات النقاء لنقاء جدار الخلية الطريقة المناسبة المطلوبة، اعتمادًا على أنواع العينات الخاصة ومتطلبات جدران الخلايا السليمة والتجربة يتم تحسين المنظفات والأساليب المختلفة.

عزل وتنقية العديد من العضيات:

إذا كان هناك حاجة إلى بروتينات عضية متعددة، يتم استخدم طريقة تجزئة العضية أو الترشيح لفصل وإثراء بروتينات العضية التي تحتاجها.

 استخراج بروتينات جدار الخلية:

لاستخراج بروتينات جدران الخلايا النباتية يستخدم بروتوكولين بديلين: (1) تقنيات غير مدمرة و(2) تقنيات مدمرة لتلبية متطلبات المشروع، بالإضافة إلى ذلك يتم استخدام طريقة استخراج (mutanolysin) لاستخراج ذوبان البروتينات المرتبطة بجدار الخلية بشكل ملائم وفعال.

استراتيجيات عزل البروتينات الغشائية:

الاستخراج والذوبان: يتم تجانس مصدر البروتينات (خلايا الثدييات والأنسجة والخلايا البكتيرية وغيرها) في محلول مناسب يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، حيث يستخدم المنظف الذي يحتوي على عازلة لاستخراج البروتينات الغشائية من طبقة ثنائية الدهون، كما تتوفر أنواع مختلفة من المنظفات مثل المنظفات الأيونية والمنظفات غير الأيونية ومنظفات الأملاح الصفراوية والمنظفات (zwitterionic).

العوامل التي يجب مراعاتها عند فحص المنظفات:

من المستبعد جدًا أن يكون المنظف المنتقى الكرز أفضل بشكل موحد لجميع أنواع البروتينات الغشائية، حيث يتطلب استخراج البروتينات الغشائية من الطبقة الدهنية توازنًا دقيقًا وتعبيرًا من خلال خصائص المواد الخافضة للتوتر السطحي المختارة وجزيئات الدهون المحيطة بالبروتين، إذ يجب أن تكون قاسية بما يكفي لتعطيل الروابط بين البروتين والدهون المحيطة، ولكن خفيفة بما يكفي لترك قوى التثبيت الداخلية للبروتين دون اضطراب.

بشكل عام فإن المنظفات التي تحتوي على مجموعات رأس صغيرة مشحونة وسلاسل ألكيل أقصر نسبيًا تكون أكثر صرامة، ويمكن أن تلحق أضرارًا كبيرة ببروتين الغشاء والمنظفات الأكثر اعتدالًا نسبيًا لها سلسلة ألكيل أطول ومجموعات رأس كبيرة ومحايدة، على سبيل المثال تعتبر المنظفات الأيونية مثل SDS فعالة ولكنها تسبب تمسخًا كبيرًا للبروتين الغشائي.

يعتمد مدى الذوبان واستقرار الغشاء على نسبة المنظف: البروتين يمكن الحصول على مجمعات كبيرة تتكون من دهون الغشاء والبروتين بنسبة منخفضة (1:10) بينما مع زيادة النسبة تصبح المجمعات أصغر في الحجم، وعندما تصل من 10: 1 إلى 20: 1، يمكن الحصول على مجمعات خالية من الدهون الغشائية، ومع ذلك يجب تحسين هذه النسبة لنوع معين من البروتين.

لا يقتصر الأمر على تركيز المنظف ونوعه فحسب بل يمكن للعديد من العوامل الأخرى، بما في ذلك تركيز المخزن المؤقت ودرجة حرارة المخزن المؤقت المستخدم في صنع الأنسجة أو تجانس الخلية التأثير على استخراج البروتين الغشائي، حيث أن التركيز الأيوني للعازل هو أحد العوامل الحاسمة لذوبان بروتينات الغشاء ومن ثم يضاف ما يقرب من 150 ملي كلوريد الصوديوم في المخازن المؤقتة مع (Polyols) لتثبيت البروتينات المذابة.

الأكثر تفضيلاً هو منظم الفوسفات (تركيز يتراوح من 0.1-0.5 م) بسبب خصائصه المعروفة بتثبيت البروتين، إذ يجب تفضيل التركيزات المنخفضة من الجلسرين لتجنب اللزوجة التي قد تعيق إزالة الأملاح في التنبيذ الفائق أو على الأعمدة الكروماتوجرافية للحصول على جزء نقي من بروتينات الغشاء.

إزالة المنظفات:

أثناء عملية الاستخراج لإذابة بروتينات الغشاء يتم استخدام فائض من المنظفات والأملاح، مما قد يؤدي إلى حدوث اضطراب في التخطيط التجريبي الإضافي، ومن ثم يجب تنظيف المنظفات والأملاح لعمل مزيج نقي من بروتينات الغشاء المستخرجة، كما يمكن استخدام طرق مختلفة لتنقية بروتينات الغشاء المذابة:

• غسيل الكلى: تعمل هذه الطريقة بشكل أفضل مع المنظفات التي تحتوي على قيمة تركيز عالية من الحبيبات الحرجة، ونسبة أقل من الوزن الجزيئي ومساحة المقطع العرضي للميلي، ولا يمكن استخدام هذه الطريقة إذا تم استخدام منظف منخفض القيمة مثل المنظفات غير الأيونية.

• الامتزاز الكارهة للماء: يمكن أن تتصرف الراتنجات أو الحبيبات الكارهة للماء كمغناطيس للمنظفات بسبب خواصها البرمائية، وهذه طريقة مناسبة للمنظفات التي تحتوي على نسبة منخفضة من cmc.

• الكروماتوغرافيا الهلامية: يمكن بسهولة فصل جزيئات المنظف عن مزيج البروتين بناءً على أحجامها باستخدام كروماتوغرافيا الهلام.

• كروماتوغرافيا التبادل الأيوني: تسخر هذه الطريقة الطبيعة البرمائية لجزيئات المنظف، إذ يمكن استخدامه لإزالة المنظفات الأيونية والأيونية zwitter.

• أعمدة النيكل وعلاماته: هذه طريقة مفيدة لتنقية بروتينات الغشاء التي يتم التعبير عنها بعلاماته.

يعد استخراج البروتين الغشائي مهمة صعبة للأسباب التالية: يتم التعبير عن بروتينات الغشاء بكمية منخفضة جدًا لذلك، للحصول على عائد أفضل يجب أن يتم التعبير عنهم في مضيف مناسب ومع ذلك، يمكن أن يكون الإفراط في التعبير عملاً شاقًا حيث توجد احتمالات للتجديد أو الانقطاع أو عدم الاستقرار، كما أن بروتينات الغشاء شديدة الكراهية للماء بطبيعتها مما يجعلها تشكل مجاميع في المحلول، وتعتبر بروتينات الغشاء صعبة من حيث التثبيت والحفاظ على السلامة الوظيفية والهيكلية، وهم أكثر عرضة لتحلل البروتياز لذلك تتطلب مزيدًا من الاهتمام في التثبيت.