تقنية الصبغة في مختبر الميكروبيولوجي

أهداف مختبر الميكروبيولوجي:

إن إحدى أهداف مختبر الميكروبيولوجي تشخيص العينات السريرية المرضية في الأمراض التي تسببها الكائنات الحية الدقيقة في مختلف أنواعها، وأيضاً معرفة العمليات الأيضية وخصائص نمو وتكاثر هذه الميكروبات لسهولة التميز بينها.

لكن هذه الكائنات الحية الدقيقة لا يمكن إن ترى بالعين المجردة لصغر حجمها، لذلك يتم استخدام المجهر الإلكتروني لمراقبة وتميز بين أنواع الميكروبات الممرضة ولأن من مميزات هذه الميكروبات ذات خلايا عديمة ألون والتباين لا يستطيع المجهر الإلكتروني تميز بين هياكل الخلايا للكائنات الحية الدقيقة، لهذا السبب تم اكتشاف تقنية الصبغة لخلايا الكائنات الحية الدقيقة بشكل مصنع داخل المختبر حتى يتمكن المجهر الإلكتروني من التميز بينها وتعرف على خصائص مختلفة للميكروبات.

ما هي تقنية الصبغة في مختبر الميكروبيولوجي؟

هي عبارة عن تقنية مصنعة تم اكتشافها لسهولة دراسة الخصائص الأيضية والهياكل الخلوية للكائنات الحية الدقيقة الممرضة، وتتم عن طريق استخدام صبغات مختلفة تعطي الهياكل الخلوية للكائنات الحية الدقيقة ألوان مختلفة وتعتمد هذه الألوان على نوع الكائن الحي الدقيق.

ومن الجدير بالذكر أن تقنية الصبغة في مختبر الأحياء الدقيقة السريري ساعدت على تصنيف الكائنات الحية الدقيقة ومن أهم هذه التصنيفات تصنيف البكتيريا إلى سالبة الجرام (gram negative) وبكتيريا موجبة الجرام (gram positive).

أنواع الصبغات في مختبر الأحياء الدقيقة السريري:

تختلف أنواع الصبغات المستخدمة في قسم الأحياء الدقيقة السريري باختلاف الكائنات الحية الدقيقة المراد صبغتها، وجميع أنواع الصبغات في قسم الأحياء الدقيقة السريري تكون على هيئة سلسلة من الخطوات المترابطة لإتمام عملية الصبغة.

1- تحضير المسحة (Smear preparation):

تعد خطوة (Smear preparation) أولى خطوات في أغلب أنواع الصبغات، وتختلف طريقة التحضير المسحة باختلاف الميديا المستخدمة في زراعة العينة الممرضة إذا كانت هذه العينة مزروعة على ميديا صلبة (solid agar – medium) أو إذا كانت العينة في ميديا من النوع السائل (broth medium).

أولاً: إذا كان العينة مزروعة في وسط ميديا صلب

• ارتداء القفازات والكمامات قبل البدء بالعمل.

• ضع قطرة صغير من الماء المقطر (distilled water) على سطح شريحة (slide).

• استخدم (loops) بعد تعقيمه باستخدام اللهب على إزالة جزء صغير من المستعمرات البكتيرية التي توجد على سطح (solid medium)، ثم يتم وضع هذا الجزء الصغير من البكتيريا على الماء المقطر (distilled water)، واستخدم (loops) على دمج الماء المقطر مع عينة البكتيريا حتى يتحول لون الماء المقطر إلى ألون الغائم.

• قم بتعقيم (loops) المستخدم في الخطوة السابقة، وذلك عن طريق حرق بقايا البكتيريا التي توجد على حلقة التلقيح باستخدام مصدر اللهب.

• ترك الشريحة (slide) التي تحتوي على الماء المقطر والبكتيريا حتى تجف بالهواء ويجب إن تكون قريبة من مصدر اللهب حتى لا تتعرض للتلوث من الهواء.

• بعد التأكد من إن الشريحة قد جفت يتم تمرير الشريحة على النار من الأعلى من 4 إلى 5 مرات تقريباً لتثبيت الحراري (heat-fix)، لكن يجب الحذر من إن تتأثر الشريحة من الحرارة لأن الحرارة قد تؤدي إلى تشوه شكل الهياكل الخلوية للكائنات الحية الدقيقة.

ثانياً: إذا كانت العينة مزروعة في وسط ميديا سائل

• يجب ارتداء القفازات والكمامات قبل البدء بالعمل.

• استخدم (loops) المعقم في إزالة جزء صغير من المستعمرات البكتيرية التي توجد في (broth medium)، ويتم مسح هذا الجزء من البكتيريا على سطح شريحة نظيفة (slide)، في هذه  الطريقة لا يتم استخدام الماء المقطر.

• ترك الشريحة بالقرب من مصدر اللهب، وتركها حتى تجف بالهواء.

• بعد التأكد من إن الشريحة قد جفت بالهواء، يتم تمريرها من 4 إلى 5 مرات من الأعلى فوق مصدر حراري وذلك من أجل التثبيت الحراري (heat-fix).

2- الصبغة البسيطة (Simple staining):

• تعد أولى خطوات الصبغة البسيطة (Simple staining) هي تحضير خطوة (Smear preparation)، بحيث بعد ذلك يتم وضعة شريحة (Smear preparation) في صبغة (methylene blue).

• ترك صبغة (methylene blue) على الشريحة لمدة دقيقة كاملة.

• بعد الانتهاء من الدقيقة، يتم مسك طرف الشريحة باستخدام ملقط معقم بواسطة اللهب، وغسل الشريحة في لطف باستخدام الماء المقطر (distilled water).

• بعد الانتهاء من عملية تغسيل الشريحة، يتم مسح الشريحة في لطف باستخدام ورق الترشيح حيث يقوم ورق الترشيح على امتصاص الصبغة الزائدة والماء المقطر الزائد المستخدم في تغسيل الشريحة.

• يتم وضع الشريحة الجاهزة تحت المجهر الإلكتروني، لمعرفة شكل خلايا الكائنات الحية الدقيقة، ومعرفة جحمها التقريبي.

3- صبغة Acid-fast technique:

• تستخدم هذه الصبغة لنوع معين من البكتيريا وتسمى (Mycobacterium) وذلك لتميزها عن غيرها من أنواع البكتيريا.

• تستخدم صبغة معينة في هذا النوع من الصبغات وتسمى (carbolfuchsin).

• يتم استخدام الحرارة أو مذيب دهني (lipid solvent) للعينة، ومن ثم يتم استخدام صبغة (carbolfuchsin).

• بعد ذلك يتم غسل الشريحة باستخدام محلول حمض الكحول المخفف (acid-alcohol solution).

• تتميز البكتيريا (mycobacterium) إن لها القدرة على مقاومة (acid-alcohol solution) لذلك تحتفظ في لون صبغة (carbolfuchsin) وتكون ضمن لون الأحمر الزاهي (bright red)، إما الأنواع الأخرى من البكتيريا يقوم محلول حمض الكحول المخفف على إزالة لون صبغة (carbolfuchsin) وتحتفظ في لون الأزرق لون صبغة (methylene blue) المستخدم في خطوة (Smear preparation).

4- صبغة Gram stain:

• تستخدم هذه الصبغة لتميز بين أنواع البكتيريا سالبة الجرام وبكتيريا موجبة الجرام.

• تكون أولى خطوات (Gram stain) هي خطوة (Smear preparation).

• يتم وضع الشريحة في صبغة (crystal violet) لمدة دقيقة واحدة، ويجب الالتزام في الوقت لمنع حدوث أي خطأ في عملية الصبغة.

• بعد الانتهاء من الدقيقة يتم غسل الشريحة بواسطة المياه (tap water) ويجب أن تكون عملية غسل الشريحة في لطف وبشكل غير مباشر حتى لا يتم إزالة صبغة (crystal violet) في الكامل.

• ثم يتم وضع الشريحة لمدة دقيقة واحدة في (Gram’s iodine) ومن ثم غسل الشريحة باستخدام (tap water) بشكل لطيف وغير مباشر.

• وضع الشريحة في عامل إزالة الون (95% alcohol) لمدة 30 ثانية.

• بعد ذلك يتم وضع الشريحة في صبغة (safranin) لمدة دقيقة واحدة.

• غسل الشريحة في لطف وبشكل غير مباشر باستخدام ماء الصنبور ومن ثم تجفيف الشريحة في لطف باستخدام ورق الترشيح.

• وضع الشريحة على المجهر الإلكتروني واستخدام عدسة 100 بعد وضع الزيت على الشريحة، بحيث سوف نلاحظ اختلاف في ألوان بين بكتيريا سالبة الجرام قد تظهر في اللون الوردي الأحمر (pink/ red) إما بكتيريا موجبة الجرام سوف تظهر في اللون الأزرق الأرجواني (blue/ purple).