التقنية المناعية النسيجية الكيميائية (Immunohistochemistry (IHC)): هي تقنية تستخدم الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيمات، والتي تحفز التفاعلات لتشكيل مركبات يمكن اكتشافها، وذلك لتوطين مستضدات معينة في عينة من الأنسجة.
خصائص تقنية IHC
تمتلك تقنية IHC العديد من الخصائص، وهي:
- تستخدم تقنية IHC الأجسام المضادة لاكتشاف موقع البروتينات والمستضدات الأخرى في أقسام الأنسجة، ويتم تصور تفاعل الجسم المضاد مع المستضد عن الكشف عن الكروموجينيك مع ركيزة إنزيم ملون، أو الكشف الفلوري باستخدام صبغة الفلورسنت.
- تستخدم تقنية IHC أجسام مضادة أولية وثانوية، وترتبط الأجسام المضادة الأولية مباشرة بالمستضد، بينما ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالجسم المضاد الأولي.
- يمكن إجراء تقنية IHC في بضع خطوات تتضمن إصلاح الخلايا والأنسجة باستخدام مادة كيميائية مثل الفورمالديهايد، وذلك لحدوث استقرار الخصائص التركيبية للخلايا، ومنعها من التغيير خلال العملية.
- ثم يتم اختراق الخلايا باستخدام منظف مثل Triton X، والذي يسمح للأجسام المضادة بدخول الأنسجة والارتباط بالحواتم داخل الخلية.
- ثم يتم إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين المهم، ويتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية مع إنزيمات مثل بيروكسيديز الفجل (HRP)، والذي يترافق مع مجال Fc الخاص بهم لاستهداف الجسم المضاد الأولي.
- يمكن أن تستهدف الإنزيمات مثل HRP جزيئات ركيزة معينة مثل ديامينوبنزيدين (DAB)، وتحفيز الأكسدة التي تؤدي إلى تكوين مركب ملون، وسيبقى هذا المركب الملون في المنطقة التي تم استهداف الجسم المضاد بها، مما يؤدي إلى تلطيخ المنطقة القريبة من البروتين المهم بلون مختلف عن باقي الأنسجة.
- وتتضمن الخطوة الأخيرة تلطيخ الأنسجة باستخدام صبغة الهيماتوكسيلين والأيوسين، وذلك لخلق تباين بين الأنسجة الملطخة باستخدام IHC والمناطق غير الملونة للحصول على تصور أفضل.
- يستخدم الأطباء تقنية IHC لتشخيص ما إذا كان الورم حميداً أو خبيثاً، ولتحديد مرحلته ودرجته، وتحديد نوع الخلية وأصل الورم الخبيث من أجل العثور على موقع الورم الأساسي.
- كما يتم تشخيص مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية والحالات غير الورمية الأخرى، باستخدام تقنية IHC كأداة أساسية أو كإجراء تأكيدي.
- يمكن استخدام تقنية IHC بمفردها أو بالاشتراك مع تقنيات تحليلية أخرى للدراسة والبحوث، مثل الأنسجة الطبيعية وتطور الأعضاء، والعمليات المرضية، والتئام الجروح، وموت الخلايا وإصلاحها، والعديد من المجالات الأخرى.
- تُستخدم تقنية IHC في تطوير الأدوية لاختبار فاعلية الأدوية، عن طريق الكشف عن النشاط أو التنظيم التصاعدي أو السفلي لعلامات المرض في الأنسجة المستهدفة وفي أي مكان آخر.
- تعتمد تقنية IHC على المناعة المناعية لأجزاء رقيقة من الأنسجة متصلة بشرائح زجاجية فردية، ويمكن ترتيب أقسام صغيرة متعددة على شريحة واحدة للتحليل المقارن.
- يتم تحضير شرائح لعمل هذه التقنية ومعالجتها وتلطيخها يدوياً، أو في مجموعات صغيرة، وتوفر التكنولوجيا الحالية خيارات أتمتة لإعداد العينات وتلطيخها بسرعة عالية.
خطوات تقنية IHC
تتضمن تقنية IHC خمسة خطوات رئيسية وهي:
1- تحضير العينة
- إن طريقة تحضير عينة الأنسجة تُحدد تركيبها، والطرق التي يمكن من خلالها اكتشاف المستضدات بواسطة الأجسام المضادة.
- إن عملية تثبيت العينة من أهم خطوات تحضير العينة، ويجب أن تتوافق طريقة التثبيت مع نوع الأنسجة المستخدمة في النتائج التجريبية المرغوبة.
- يمكن استخدم الأنسجة المجمدة أو التثبيت بالأسيتون، وذلك للكشف عن مستضد جيد.
- تعتبر عينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين (FFPE) من أفضل الطرق للحفاظ على شكل الخلية.
2- استرجاع المستضد
- يعتبر الكشف عن المستضد خطوة ضرورية، حيث أن عملية تثبيت الأنسجة عادةً تؤدي إلى ارتباط متقاطع للبروتينات.
- يمكن عكس الارتباط المتقاطع للبروتينات بسهولة من خلال الحرارة، أو المعالجة العازلة البسيطة، أو هضم بالإنزيم البروتيني.
- يعتمد اختيار العلاج على طريقة تكوين الحلقة اللازمة لاكتشاف الجسم المضاد، وتعيد هذه الخطوة الكشف عن الحلقات الموجودة على المستضد، وتسمح بربط الجسم المضاد.
3- قفل الخلفية
- يعد منع الإنزيمات الداخلية والأجسام المضادة داخل الأنسجة أمراً بالغ الأهمية، وذلك لتقليل تلطيخ الخلفية وتقليل التلوين الإيجابي الكاذب.
- يتم تحقيق عملية المنع عن طريق احتضان العينات بمخزن مؤقت، فيحجب ذلك المواقع غير المحددة التي قد ترتبط بها الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية.
4- كشف الهدف
- عند اختيار جسم مضاد أولي، يتم التأكد من أنه قد تم اختباره في تطبيقات الكيمياء المناعية.
- تشتمل مجموعة الأجسام المضادة لـ Invitrogen على أكثر من 36000 من الأجسام المضادة عالية الجودة، تم تحسينها واختبارها من أجل تقنية IHC.
- يتم توفير الأجسام المضادة الأولية عن طريق الطرق غير المباشرة، أو بتنسيق مترافق لطرق الكشف المباشر أو لتعدد الإرسال.
- تتوفر الأجسام المضادة الثانوية في مجموعة من الاتحادات الخاصة بالقياس اللوني أو الكروموجينيك، أو تقنية IHC القائمة على التألق.
5- تصوير العينة
- يتم استخدام أكثر أنظمة الفحص المجهري ابتكاراً، وذلك للحصول على صور للأنسجة الملطخة بالأجسام المضادة ذات العلامات اللونية أو الفلورية.
