اقرأ في هذا المقال
صبغة أو طريقة غرام (Gram Stain or Method): هي طريقة تلطيخ مخبرية مهمة في علم الأحياء الدقيقة، والتي تُستخدم لتصنيف الأنواع البكتيرية إلى مجموعتين مختلفتين هما: البكتيريا موجبة الغرام والبكتيريا سالبة الغرام، مما يساعد في تصنيف الأنواع البكتيرية وتميزها عن بعضها.
مكونات صبغة غرام
تتكون صبغة غرام من أربعة مكونات رئيسية، وهي:
1- الكريستال البنفسجي
- الكريستال البنفسجي (Crystal violet): هي صبغة ثلاثية الميثان، والتي تحتوي خصائص مضادة للفطريات وطاردة للديدان، وتسمى بميثيل البنفسجي 10B أو كلوريد هيكساميثيل باراروسانيلين.
- تنتج صبغة الكريستال البنفسجي عن طريق تفاعل ثنائي ميثيلانيلين مع الفوسجين لإعطاء مركب معقد يتفاعل مع ثنائي ميثيلانيلين في وجود أوكسيد كلوريد الفوسفور وحمض الهيدروكلوريك، أو عن تكثيف الفورمالديهايد وديميثيلانيلين لإعطاء صبغة ليوكو ثم تأكسد هذا المركب عديم اللون إلى الشكل الموجب الملون (الكريستال البنفسجي).
2- اليود
- اليود (Iodine): هو عنصر كيميائي يرمز له حرف I، والرقم الذري له هو 53.
- يعد اليود أثقل الهالوجينات المستقرة، ويوجد على شكل مادة صلبة غير معدنية شبه لامعة.
- يمكن إذابة اليود في ظروف قياسية لتكوين سائل بنفسجي عميق عند درجة حرارة 114 درجة مئوية، ويمكن غليه عند درجة حرارة 184 درجة مئوية ليتحول إلى غاز بنفسجي.
- يتم استخدام اليود السائل في صبغة غرام.
3- مزيل اللون
- يتم استخدام الكحول أو الأسيتون كخطوة في صبغة غرام لإزالة اللون، وهي مركبات كيميائية عضوية سائلة عديمة اللون، ولها رائحة، مميزة وقابلة للاشتعال.
4- السفرانين
- السفرانين (Safranin): صبغة بيولوجية تستخدم في علم الأنسجة وعلم الخلايا، واللون الأساسي فيها هو اللون الأحمر لذلك تسمى اللون الأحمر الأساسي أو السفرانين O.
- تستخدم السفرانين كآخر خطوة من خطوات صبغة غرام.
خصائص صبغة غرام
إن صبغة غرام تمتلك العديد من الخصائص المميزة، وهذه الخصائص هي:
- إن صبغة غرام من أكثر الصبغات استخداماً في مختبر الميكروبيولوجي، والتي تكشف عن أنواع البكتيريا وتميز بين بكتيريا موجبة غرام وبكتيريا سالبة الغرام.
- لقد طور هذه الصبغة عالم البكتيريا الدنماركي هانز كريستيان غرام عام 1884، ولهذا سميت على اسمه.
- إن العالم غرام ابتكر طريقة غرام ليس لغرض تمييز أنواع البكتيريا عن بعضها؛ ولكن لجعل البكتيريا أكثر وضوحا في الأجزاء الملطخة.
- تتميز صبغة غرام بتلوينها لجدران البكتيريا اعتماداً على الخصائص الكيميائية والفيزيائية لها.
- يتم عمل صبغة غرام على عينات سوائل الجسم أو الخزعات عند الاشتباه في وجود عدوى بكتيرية.
- إن نتائج التلطيخ بصبغة غرام أسرع بكثير من نتائج الزراعة، وهي مهمة بشكل خاص عندما تحدث العدوى فرقاً مهماً في علاج المريض والتنبؤ بالمرض.
آلية عمل صبغة غرام
يقوم مبدأ عمل صبغة غرام على:
- تعتمد صبغة غرام على مكونات الجدار الخلوي للخلية البكتيرية.
- تحتوي الجدران الخلوي لبعض أنواع البكتيريا على طبقة سميكة تتكون من الببتيدوغليكان (Peptidoglycan) فقط، والبعض الآخر من الأنواع البكتيرية تحتوي جدرانها الخلوية على عديد السكاريد الدهني المعقد (Lipopolysaccharide) والببتيدوغليكان.
- يتفكك الكريستال البنفسجي في المحاليل المائية إلى أيونات موجبة وأيونات سالبة.
- تخترق هذه الأيونات جدار الخلية للأنواع البكتيرية المختلفة.
- تتفاعل الأيونات الموجبة من الكريستال البنفسجي مع المكونات السالبة لجدار الخلية البكتيرية، وتقوم بتلطيخ الخلية باللون الأرجواني.
- يتفاعل اليود مع الأيونات الموجبة، ويشكل معقدات كبيرة من الكريستال البنفسجي واليود (CV-I) داخل الطبقات الداخلية والخارجية للخلية، وهو عنصر لاذع ومحاصر يمنع إزالة مركب (CV-I)، وبالتالي يلون الخلية.
- يتفاعل مزيل اللون (الكحول أو الأسيتون) مع الدهون في غشاء الخلية؛ فتفقد الخلية عديد السكاريد الدهني الخارجي، ويتم ترك طبقة الببتيدوغليكان الداخلية مكشوفة، ويغسل مركب (CV-I) من الخلية مع الطبقة الدهنية (عديد السكاريد الدهني)، في حين الخلية التي تحتوي على الببتيدوغليكان فقط تصبح مجففة من مزيل اللون.
- تصبح مجمعات مركب (CV-I) الكبيرة محاصرة داخل الخلية المحتوية على الببتيدوغليكان فقط.
- ملاحظة هامة: تتم إزالة الصبغة الكريستالية البنفسجية من الخلايا ذات النوعيين إذا تُرك عامل إزالة اللون لفترة طويلة جداً.
- بعد عملية إزالة اللون تظل الخلية ذات الأنواع المحتوية على الببتيدوغليكان فقط أرجوانية، وتفقد الخلية ذات الأنواع الأخرى لونها الأرجواني.
- يتم وضع الصبغة المضادة السفرانيين، والتي عادة ما تكون مشحونة إيجابياً؛ لإعطاء البكتيريا منزوعة اللون الأرجواني لوناً وردياً أو أحمراً.
- تلتقط كل أنواع الخلايا البكتيرية الصبغة المضادة، ولكن البقع المضادة غير مرئية على الخلية البكتيرية المحتفظة باللون الأرجواني؛ وذلك لأن صبغة الكريستال البنفسجي داكنة.
كيفية إجراء صبغة غرام
يتم إجراء صبغة غرام بالخطوات التالية:
- يتم وضع العينة على شريحة نظيفة، ثم تركها لتجف في الهواء الجاف، ثم القيام بعملية تثبيت لها بواسطة الحرارة (Fixation).
- يتم سكب الكريتسال البنفسجي على العينة، وتركها لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة، ثم تُشطف بالماء.
- يتم غمر العينة باليود لمدة دقيقة، ثم غسلها بالماء.
- يتم وضع مزيل اللون باستخدام 95٪ كحول أو أسيتون لمدة 10-20 ثانية، ثم يتم شطفها بالماء.
- يتم إضافة السفرانين لمدة دقيقة واحدة، ثم يتم غسلها بالماء.
- تُترك العينة لتجف في الهواء قليلاً، ثم يتم رؤيتها تحت المجهر.
نتيجة صبغة غرام
تكون نتيجة عمل صبغة غرام كالتالي:
- إن الخلية البكتيرية التي تحتفظ باللون الأرجواني تسمى البكتيريا موجبة غرام، بينما البكتيريا التي لا تحتفظ باللون الأرجواني ويتغير لونها للأحمر أو الوردي تكون بكتيريا سالبة غرام.
