تحليل المركبات الكيميائية وتأكيده هوياتها يعد جزء مهم من الكيمياء العملية، وبالإضافة الى التطبيقات في المعامل البحثية، وأيضا التحليل اليومي، يعدان جزء من عمل العلماء في مجالات مثل مجالات المستحضرات الصيدلانية، مجالات الصناعة، مجالات مراقبة جودة الطعام والشراب، مجالات المراقبة البيئية ومجالات الطب الشرعي.
ما هي تقنيات الفصل والتنقية؟
تقوم المختبرات الحديثة بتقديم مجموعة واسعة من التقنيات التحليلية المختلفة، وهناك مقدمات للعديد من التقنيات المختلفة مثل: (قياس الفولتميتر الدوري، المجهر الإلكتروني النافذ، تقنية المغناطيسية، تقنية الانبعاث والتحليل الطيفي).
في البداية يجب علينا أن نفهم أن المكون الذي يتم تحليله في نظام يسمى المحللة أو المادة المراد تحليلها (analyte)، كما أنه قبل أن نبدأ في تحليل أي المركب، من الضروري والمهم أن نقوم بالتأكد من درجة نقاوتها، ومن الطرق الروتينية في فصل وتنقية المركبات الكيميائية هي كالتالي: كروماتوغرافيا الغاز أو ما يعرف بالاستشراب الغازي، اللوني السائل ما يعرف بالاستشراب السائل، سائل فاصل للون عالي الكفاءة أو ما يعرف باستشراب السائل رفيع الإنجاز، إعادة التبلور.
الاستشراب الغازي Gas chromatography (GC)
كروماتوغرافيا الغاز (GC): هي عبارة عن تقنية فصل تتم فيها المرحلة المتنقلة (mobile phase)، وتكون عبارة عن غاز، والمرحلة الثابتة (stationary phase) معبأة داخل العمود شعري أو (microbore)، كما ويستخدم كروماتوغرافيا الغاز (GC) لفصل المكونات المتطايرة من خليط ما، ويعتمد على التفاعلات المختلفة بين مكونات المرحلة المتنقلة (الناقل بها غاز)، مع المرحلة الثابتة (مثل الألومينا أو السيليكا) والمتواجدة في عمود الكروماتوغرافيا.
يتم حقن العينة في تدفق الغاز الحامل المجفف والذي يتم تسخينه بحيث تكون مكونات العينة في مرحلة البخار، ويتم أخذ العينة في كروماتوغرافيا الشعيرات الدموية أو المسام الدقيقة، حيث يتم التحكم في درجة الحرارة؛ وذلك للحفاظ على حالة البخار للعينات.
أما بالنسبة لعدد المرات التي تستغرقها المكونات في الخليط ليتم التخلص منها، من العمود اللوني هي عبارة عن خاصية الاحتفاظ، والبيانات يتم إخراجها كروماتوجرام (قطعة من الشدة النسبية مع الزمن).
والمكونات في العينة الأقل تفاعلًا مع المرحلة الثابتة، لديها أقل أوقات احتفاظ، بينما التي تمتلك قوة أكبر تتحرك مكوناتها المميزة ببطء أكثر خلال العمود الشعري، بينما يتم تطبيق GC بشكل روتيني لفصل المركبات المتطايرة.
الاستشراب السائل Liquid chromatography (LC)
الكروماتوغرافيا السائلة (LC) لها تطبيقات أوسع في الكيمياء غير العضوية، اللوني السائل (LC) هي عبارة عن تقنية فصل وهي المرحلة المتحركة فيها تكون فيها عبارة عن سائل، أما المرحلة الثابتة إما تكون معبأة داخل عمود أو ملتصقة بلوح زجاجي.
أما لتنقية المنتج بعد عملية التوليف أو حدوث العملية بشكل عام، غالبًا ما يتم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة، المواد الخام يتم ادمصاصها على المرحلة الثابتة (مثل الألومينا أو السيليكا بقطر جسيمي يبلغ 20 مم تقريبا)، العمود مزال مع خليط مذيب (الطور المتحرك) تم اختيارها لفصل المكونات بناءً على اختلافها في الذوبان والتفاعلات مع المرحلة الثابتة.
يتم إجراء عمليات الفصل الاختبارية أولاً باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)، نسبة المسافة المقطوعة من المادة المراد تحليلها على المذاب تسمى بعامل الاحتفاظ (قيمة Rf)، حيث يتم إنشاء توازن بين السطح ودقائق المحلول، وتفضيل معين ،كما ويتم إعطاء الأنواع للمرحلة الثابتة أو المتنقلة بواسطة ما يعرف بثابت التوازن K، حيث أن: (K = α(stationary) / α(mobile
عند التركيز المنخفض يمكن تقريب الأنشطة (activities) والتي هي (α)، إلى التراكيز (concentrations)، (C)، بما أن العمود مزال (eluted) بالمذيب، فإنه تتم إزالة بعض المكونات من المرحلة الثابتة أكثر سهولة من غيرها، كما أن فصل الخليط قد تحقق، يمكن أن يتم رصد الانفصال بالعين لكن طرق الكشف الفعالة تكون عبارة عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية والتحليل الطيفي أو قياس الطيف الكتلي.
الاستشراب السائل رفيع الإنجاز High-performance liquid chromatography (HPLC):
يعتبر اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) أحد أشكال الكروماتوغرافيا السائلة، والتي تكون فيها المرحلة المتنقلة أدخلت تحت الضغط، وتتكون المرحلة الثابتة من جسيمات صغيرة جدًا (قطرها يتراوح 3-10 مم).
تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، جميع أجزاء الفاصل يتم التحكم في العملية بواسطة الكمبيوتر، حيث يتم تفريغ المذيبات من الغازات قبل الاستخدام، ويتم التحكم في معدل تدفق كل مذيب بحيث يكون لخليط المذيبات الذي يدخل المضخة تكوين محددًا مسبقًا، تعمل المضخة تحت ضغط تقريبا يساوي 40 ميجا باسكال، ومعدل التدفق الذي توفره المضخة متنوع على النحو المطلوب.
بعد أن يتم حقن العينة، يدخل الطور المتحرك في العمود اللوني، تتم مراقبة الكسور المزالة باستخدام كاشف (على سبيل المثال الأشعة فوق البنفسجية المرئية، وعملية الفلورة والأشعة تحت الحمراء أو مطيافية ثنائية اللون دائرية أو قياس الطيف الكتلي)، ويتم تسجيل البيانات بتنسيق، وعلى سبيل المثال، يتم تسجيل بيانات الامتصاصية مقابل بيانات زمن الاحتفاظ.
يستخدم HPLC التحليلي أعمدة بطول 3-25 سم وعرض 2-4 مم، وقطر جسيمات المرحلة الثابتة 3-10 ملم، وقد يستخدم HPLC التحضيري ما يصل إلى 1 غرام من العينة، بأعمدة بطول 25 سم وقطرها 10-150 مم.
في HPLC في المرحلة العادية، المرحلة الثابتة هي عبارة عن مادة ماصة قطبية مثل السيليكا (قطر جسيم موحد 10 مم) وتكون معبأة في عمود، وعادة ما تكون المذيبات غير قطبية، أو ذات قطبية منخفضة.
يتم استخلاص الكسور من العمود عن طريق ترتيب قطبيتها، مع التصفية التكميلية للمكونات غير القطبية، كما أن الخصائص الفاصلة للبدائل في المركب لها تأثير كبير على معدل الشطف، في HPLC ذو المرحلة العكسية، سطح المرحلة الثابتة يتم تعديله بحيث يكون كارهًا للماء، ويتم الجمع بين هذا بمذيبات قطبية، كما أنه عادة ما يكون الماء ممزوجًا بـ (MeOH، MeCN) أو (THF)، ويتم استخلاص الكسور من العمود عن طريق تناقص القطبية.
وهناك مثال على تطبيق (HPLC)، وهو الفصل من الفوليرينات (fullerenes)، معبأة مع الأعمدة مراحل ثابتة مصممة خصيصًا للمقياس التحضيري، يتوفر فصل الفوليرين تجاريًا (على سبيل المثال: CosmosilTM Buckyprep columns).
إعادة التبلور Recrystallization:
إعادة التبلور هي عبارة عن خطوة تنقية تنطوي على الذوبان والتبلور لمادة صلبة من خليط مذيب، بعد التوليف والفصل الكروماتوجرافي للمادة الصلبة، عادة ما تستخدم إعادة التبلور على أنها خطوة تنقية نهائية.
افترض أنك ترغب في فصل مركب A من الشوائب الصغرى. أولاً، من الضروري العثور على ملف مذيب يكون فيه A غير قابل للذوبان في درجات حرارة منخفضة، ولكنه قابل للذوبان جدا في درجات حرارة أعلى، عادةً ما تكون القطبية أو المركبات الأيونية قابلة للذوبان في المذيبات القطبية (مثل الماء، أسيتونيتريل، ثنائي كلورو ميثان، ميثانول)، حيث إن المركبات غير القطبية قابلة للذوبان في المذيبات غير القطبية (مثل الهكسانات، التولوين)، وقد تكون الشوائب أيضًا قابلة للذوبان في نفس خليط المذيب.
ولكن، من الناحية المثالية، تم العثور على مذيب فيه الشوائب غير قابلة للذوبان، للحالة الأخيرة، وبعد الاختبارات الأولية للعثور على المذيب المناسب، يضاف المذيب إلى الخام A ويسخن الخليط، في حين أن الشوائب غير القابلة للذوبان يتم إزالتها عن طريق ترشيح المحلول الساخن، كما ويسمح لسائل الترشيح بالتبريد إما عند درجة حرارة الغرفة أو أقل منها.
عندما يبرد المحلول، تقل قابلية ذوبان A وبمجرد أن يصبح المحلول مشبعًا، يبدأ A في التبلور في المحلول، وإذا كان التبلور سريعا نسبيًا فإن شكل البلورات يكون دقيق(microcrystals)، وإذا كان كل من (A) والشوائب قابل للذوبان في نفس المذيب، فإنه يتم إذابة العينة الخام في مذيب مغلي ويترك المحلول ليبرد ببطء.
يتضمن النمو البلوري تجميع الكرستالية البلورية الشعرية؛ والهدف من ذلك هو استبعاد الشوائب من الشبكة.
