الطرد المركزي التفاضلي:
تم تقديم الطرد المركزي التفاضلي لأول مرة من قبل بنسلي وهور في عام 1934 الذين حصلوا على جزء حبيبي كبير يحتوي على نوى وميتوكوندريا، حيث سرعان ما أصبح من المعتاد استخدام دوران منخفض السرعة 10 دقائق عند 600 جم لترسيب الخلايا غير المكسورة، مما يؤدي إلى تلويث كريات الدم الحمراء، وغالبًا ما تستخدم الأنسجة المروية لتقليل التلوث من الدم والنواة.
كما أوصى كلود بضرورة تمرير النسيج في البداية من خلال غربال معدني أو شاشة لإزالة النسيج الضام، مما يجعل التجانس أسهل وأقل ضررًا للعضيات داخل الخلايا، حصل كلود على ثلاثة أجزاء هي الحبيبات الكبيرة الميتوكوندريا، الحبيبات الصغيرة (الميكروسومات)، وكسر غير قابل للترسيب.
كان اختيار الوسيلة مهمًا إذ كان وجود الأيونات التي يشيع استخدامها في المحاليل الفسيولوجية أمرًا غير مرغوب فيه؛ لأن الجزيئات تتجمع، كما تم إدخال السكروز كمادة رخيصة عالية النقاء غير سامة قابلة للذوبان، والتي أعطت كسور نشطة كيميائيا.
في الأصل تم استخدام 0.88 M من السكروز لأن مورفولوجيا الميتوكوندريا في (EM) كان ممتازًا في ذلك الوقت، حيث كانت الميتوكوندريا ممدودة وشكلها قضيب ومع ذلك، إذا كان السكروز متساويًا (0.34 أو أكثر عادة 0.25 م) يتم الاحتفاظ بالفسفرة المؤكسدة، وبما أن أوقات الترسيب كانت أقصر مع وجود سكروز أقل تركيزًا أصبح 0.25 مليون سكروز هو الطريقة المفضلة، الميتوكوندريا في هذا الوسط كروية.
سرعان ما أظهرت التحليلات البيوكيميائية والبنية التحتية أن الكسور التي تم الحصول عليها كانت غير متجانسة، حيث اقترح هارفي (1931) أن الطرد المركزي المتدرج الكثافة قد يوفر وسيلة أكثر دقة لفصل الجسيمات بدلاً من حجمها، وتم تقديم هذا بواسطة هولتر (1953) باستخدام محاليل السكروز بكثافة متفاوتة في جهاز طرد مركزي بدلو متأرجح.
تم إعادة تعليق كسور الخلايا الخام التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ووضعها في طبقات فوق تدرجات السكروز، حيث يمكن إعدادها لإعطاء كثافة متزايدة باستمرار نحو قاع أنبوب الطرد المركزي أو بشكل أكثر شيوعًا لإعطاء عدة نطاقات متميزة.
نتائج الطرد المركزي التفاضلي:
أدى الطرد المركزي بالتوازن الآن إلى جسيمات من نفس الحجم ولكن بكثافة مختلفة تفصل نفسها بشكل مناسب وكانت عمليات الاسترداد في الطرد المركزي التفاضلي الأول جيدة في العادة (> 80٪) إذ أعطى ترسيب التوازن كسورًا نظيفة جدًا ولكن غلات أقل.
أظهرت بعض النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلي توزيع الإنزيمات بين الكسور الخلوية المختلفة التي يصعب تفسيرها، حيث تم العثور على إنزيمات مثل (carbamoyl phosphate synthase) أو (isocitrate dehydrogenase) في كل من الميتوكوندريا والجزء القابل للذوبان من الخلية.
أدى ذلك إلى دراسات حركية مفصلة مع الإنزيمات المنقاة، والتي أشارت إلى احتمال وجود مجموعات من الإنزيمات بخصائص مختلفة قليلاً (إيزوزيمات) تحفز تفاعلات مماثلة في أجزاء مختلفة أو في أنواع خلايا مختلفة، يبدو أن التغيرات في السلوك الحركي تعمل على تكييف الإنزيم بشكل مناسب مع الحيز أو الخلية المعينة التي حدث فيها التفاعل.
نشأ قدر أكبر من عدم اليقين عندما تم اكتشاف كميات صغيرة جدًا من أحد المكونات خارج العضية التي كان يتركز فيها بشكل أساسي، وعندما كانت الملاحظة قابلة للتكرار مثل وجود كميات صغيرة من الحمض النووي (أقل من 1 ٪ من إجمالي الحمض النووي الخلوي) في الميتوكوندريا عالية النقاء فقد تطلب الأمر عملًا كبيرًا على حجم وتكوين وتنظيم الحمض النووي للميتوكوندريا قبل قبول أهميته.
يمكن استخدام الميتوكوندريا المحضرة بالطرد المركزي التفاضلي لكل من تخليق التشغيل وكمصدر للـ (RNAs) المخصب في نسخ الميتوكوندريا المصنوعة في الجسم الحي، حيث يمكن الحصول على كميات معقولة من المواد الخلوية من مزارع البلازما الكبيرة أو الميكروبلازما.
لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في مدى تخليق الحمض النووي الريبي أو مستويات التحرير بين الميتوكوندريا المعزولة من البلازما الكبيرة أو الميكروبلازمديا، إذ تعد البلازمات الكبيرة أكثر ملاءمة بشكل عام للاستخدامات الصغيرة، وتُستخدم الميكروبلازموديا بشكل عام في التجارب على نطاق أوسع.
يمكن استخدام خطوات تنقية إضافية على سبيل المثال بيركول عند الرغبة في المزيد من الميتوكوندريا عالية النقاء، ولكن يفضل بشكل عام الميتوكوندريا الخام بسبب الانخفاض في إجمالي المحصول والنشاط أثناء التنقية، إذ يجب عزل الميتوكوندريا حديثًا عند الحاجة؛ لأن هذه المستحضرات تفقد نشاطها بسرعة حتى عند تخزينها عند -80 درجة، ويتم الاحتفاظ بجميع المحاليل والمعدات باردة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك ويلاحظ أن قيم الأس الهيدروجيني مقتبسة لدرجة حرارة الغرفة.
