كيفية زراعة الخلايا النباتية والأنسجة

زراعة الأنسجة هو المصطلح المستخدم لعملية زراعة الخلايا بشكل مصطنع في المختبر، وتشمل زراعة الأنسجة كلا من النبات والخلايا الحيوانية.

أنواع الخلايا والأنسجة المزروعة

تم إجراء زراعة الخلايا والأنسجة النباتية بأشكال مختلفة منذ ثلاثينيات القرن الماضي على الرغم من أنّ التقنيات مشتقة من تقنيات أقدم بكثير لتكاثر النباتات، مثل أخذ قطع من النبات والتي قام بها البستانيون لعدة قرون، وتعتمد التقنيات على حقيقة أنّ النباتات تظهر مرونة التطور والقدرة على تغيير مسار النمو إذا تم تشغيلها بشكل مناسب.

وبالتالي يمكن للقسم الجذعي أن يعيد توليد الجذور والأوراق لتحقيق نبات كامل وفعال، ويمكن أن تتسبب الخلايا المفردة في تكوين جنين جديد بالكامل، تتطلب زراعة الأنسجة النباتية ظروفًا معقمة حيث يكون نمو الأنسجة بطيئًا والمواد في المزرعة عرضة للعدوى الفطرية والبكتيرية، والأنواع الرئيسية لاستنبات النباتات المعقمة هي:

1- زراعة الأعضاء حيث ينمو عضو (برعم زهرة وفاكهة غير ناضجة) معزولاً عن النبات الأم.

2- زراعة جنين ينمو فيها جنين منعزل أو غير ناضج.

3- زراعة الأنسجة حيث يتم إنماء مادة الخلية المعزولة من النبات الأم لتكوين الكالس (كتلة غير متمايزة من الخلايا) أو لتجديد الأعضاء أو إلى نبات كامل.

4- المزارع المعلقة التي تنمو فيها الخلايا المعزولة أو الكتل الصغيرة من الخلايا في وسط سائل.

تُستخدم الخلايا البروتوبلاستية وهي الخلايا التي أزيل منها جدار الخلية عن طريق الهضم الإنزيمي في زراعة الخلايا لفصل الخلايا المفردة عن كتل الخلايا.

الطرق والوسائط والمعدات لزراعة الخلايا النباتية

يتم تحضير الخلايا التي سوف يتم زراعتها في بيئة شبه معقمة وعادةً ما تكون خزانة تدفق صفائحي، حيث تهب مسودة من الهواء المعقم باستمرار عبر سطح العمل باستخدام معدات ووسائط معقمة بالحرارة أو في الأوتوكلاف أو ما يعرف بجهاز التعقيم، وتم تطوير مجموعة واسعة من الوسائط الصلبة والسائلة لتطبيقات مختلفة، ويجب أن تحتوي الوسائط على مكونات رئيسية معينة، فقبل استخدامها يتم تعقيمها ومعالجتها في ظروف معقمة باستخدام أوعية معقمة أو أطباق بتري.

من أجل البدء بخلية صلبة أو زراعة الأنسجة يجب الحصول على جزء معقم (نسيج مُزدرع) ووضعه في وسط النمو، وفي البداية سيتم تكوين كتلة غير متمايزة من الخلايا تسمى الكالس أو جُسأة (callus)، ويمكن القول بأنّ النقاط التالية هي المراحل المعنية لزراعة الخلايا النباتية:

1- اختيار نبات سليم وإزالة جزء من الأنسجة في غطاء التدفق الصفحي.

2- تعقيم السطح باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم المخفف.

3- استئصال جزء من الأنسجة باستخدام أدوات معقمة وإعادة ترسب الأنسجة.

4- وضع القطعة على وسط صلب يحتوي على هرمونات ومغذيات للحث على تكاثر الخلايا في طبق بتري.

5- الختم والاحتضان عند (22) درجة مئوية.

6- المراقبة المنتظمة والتخلص من جميع الأطباق الملوثة.

7- عندما يكون نمو الكالس كافيًا يتم إزالته إلى وسط جديد لبدء التمايز.

في كثير من الأحيان يتم اختبار مجموعة من الأوكسين وهما: نسب السيتوكينين لتحسين النمو والتنمية، وقد تكون هناك حاجة لعدة عمليات نقل إلى وسط طازج إذا كان تكوين النباتات الصغيرة مطلوبًا، وقد تستغرق العملية بأكملها من (8 إلى 12) أسبوعًا أو أكثر حتى تكتمل.

تعليق زراعة الأنسجة

يبدأ تعطيل وتعليق زراعة الأنسجة عن طريق تكسير الخلايا الخالية من الكالس عن طريق التحريض اللطيف، وهي تتكون من خلايا مفردة أو كتل خلوية معلقة في وسط سائل بهواء، وأبسط نظام ثقافة التعليق هو دورق مخروطي يهتز برفق على منصة حاضنة مدارية، وتحافظ حركة الدوران على الخلايا في حالة تعليق وتؤكسج الوسط.

وتظهر الخلايا في المزرعة المعلقة نموًا لوغاريتميًا مع زيادة سريعة في الوزن الطازج والوزن الجاف ومحتوى الحمض النووي (يشير إلى انقسام الخلايا) خلال الأيام القليلة الأولى، ويتبع ذلك انخفاض في انقسام الخلايا وبالتالي انخفاض في معدل النمو، وإذا لم تعط الخلايا وسطًا جديدًا فسوف تموت بعد ذلك، ومع ذلك إذا تمت إزالة قسامة صغيرة وزرعها في وسط جديد يمكن تكرار العملية بأكملها إلى أجل غير مسمى.

وعندما يكون الهدف من العملية هو حصاد منتجات ثانوية مثل: صبغة شيكونين المضادة للميكروبات، فإنّ الإنتاج الأمثل يحدث غالبًا في وقت متأخر من دورة النمو عندما يبدأ موت الخلايا في الحدوث، وتم تحسين الوسائط للحفاظ على الخلايا في الثقافة لكل نوع خلية وستتضمن أوكسين وسيتوكينين لتحفيز انقسام الخلايا.

بعد الزرع المطول قد تتغير الخلايا في خصائصها نتيجة للطفرة أو تنشيط الجينات غير النشطة سابقًا، وبعد تكرار الثقافة الفرعية على سبيل المثال يمكن تنشيط جينات التخليق الحيوي للسيتوكينين، وتفقد زراعة الأنسجة متطلباتها من السيتوكينين في وسط المزرعة، وتُعرف هذه العملية باسم التعود، ويعد توسيع نطاق تعليق زراعة الأنسجة إلى أوعية استزراع كبيرة أمرًا صعبًا مثل:

1- يجب الحفاظ على الظروف المعقمة.

2- التهوية المستمرة مطلوبة.

3- تتلف الخلايا بسهولة بواسطة أدوات التقليب والتغيرات في الضغط.

4- تتطلب الخلايا إثارة مستمرة، وتم التغلب على هذه المشاكل في عدد من التصاميم.

التمايز والتكوين الجنيني

يتم إجراء العديد من التجارب في زراعة الخلايا بهدف تجديد نبات كامل، وهذا مهم بشكل خاص للتعديل الجيني حيث يمكن إدخال جين جديد في تعليق الخلية أو البروتوبلاست أو الكالس ويجب إنتاج نباتات كاملة، وتنقسم الخلايا بشكل عشوائي لتشكيل كتلة غير متمايزة تعرف باسم الكالس، وإذا كانت نسبة “الأوكسين: السيتوكينين” متغيرة في الوسط فيمكن تحفيز الكالس على التمايز لتشكيل الجذور والبراعم، ومن خلال الزراعة الفرعية يمكن تجديد النباتات السليمة بهذه الطريقة.

قد تشكل مزارع الكالس أيضًا أجنة (أجنة جسدية أي أجنة تتشكل في الزراعة على عكس الأجنة الملقحة التي تشكلت جنسيًا في النبات) على الوسائط المناسبة، وتسمى زراعة الأنسجة القادرة على توليد الأجنة بالجنين.

التطبيقات التجارية والصناعية

التكاثر الدقيق هو استخدام زراعة الأنسجة النباتية لتجديد أعداد كبيرة من النباتات، وينتج عن هذه التقنية نباتات متطابقة وراثيًا وبالتالي فهي تكاثر نسلي ويتم استخدامها بشكل شائع لإنتاج نباتات خالية من الأمراض، وتجاريًا للعديد من الأنواع بما في ذلك الأشجار والبطاطس وبساتين الفاكهة وكجزء من إجراء معالجة المحاصيل وراثيًا، ويمكن تغليف الأجنة الجسدية في هلام رطب لإنتاج بذرة اصطناعية أو تكاثر.

إنتاج المنتجات الثانوية في نظام تعطيل الاستزراع

يصعب إنتاج العديد من المنتجات النباتية الثانوية عن طريق التوليف العضوي، وتم بذل جهد كبير في استخدام مزارع تعليق النبات لصنعها، ويتم إنتاجها غالبًا بواسطة خلايا متخصصة للغاية، وبالتالي لا يمكن الحصول على عوائد عالية في زراعة الخلايا إلّا إذا كانت الثقافات تعبر عن الجينات المطلوبة.

في كثير من الأحيان يحدث هذا فقط عندما تكون الخلايا في نهاية دورة الزراع للأنسجة، ومثال على مركب تم إنتاجه بنجاح في المزرعة هو صبغة “شيكونين” المضادة للميكروبات التي تنتجها مزارع “قوبتيس جابونيكا”، ويعد التلاعب الوراثي للنبات تطبيقًا واسع النطاق لتقنيات زراعة الخلايا والأنسجة النباتية اليوم وبدون ذلك لن يكون من الممكن تسويق المحاصيل المعدلة وراثيًا.