لا تعتبر جميع خلايا المجتمع البكتيري خلايا حية، فالخلايا الحية هي تلك الخلايا التي تنمو في الأوساط السائلة منتجه عكوره فيها أو التي تنمو على الأوساط الصلبة منتجه مستعمرات عليها، يسمى العد المتضمن مجموع الخلايا البكتيرية الحية والميتة بالعدد الكلي (Total count) بينما يسمى العدد المتضمن الخلايا الحية فقط بالعد الحي (Viable Count).
طرق عد البكتيريا
1- تحديد العدد الكلي Total Count
يتم تحديد العدد الكلي للأحياء المجهرية باستخدام الطرق التالية:
الطريقة المباشرة Direct Method
يتضمن الفحص باستخدام المجهر وذلك بالطرائق التالية:
- حجيرة العد (Counting chamber): تستخدم في حساب أعداد الخلايا البكتيرية حيث تحتوي على 9 مربعات وسطية بعمق 0.1 مم ومساحة مربعة تساوي 1/400مم مربع.
- طريقة بريد (Breed method): هي من الطرق المباشرة المستخدمة لحساب أعداد الأحياء البكتيرية الكلي في عينات الحليب وتتخلص بوضع 0.02 مل من العينة المراد فحصها وفردها على مساحة 3سم مربع من الشريحة حيث تجفف الشريحة وتثبيتها ثم تصبغ بإحدى الصبغات البسيطة مثل ازرق المثيلين لمدة 1-2 دقيقة ثم تغسل الشريحة بالماء وتجفف ثم تفحص باستخدام المجهر، وبالتالي يتم حساب الأعداد المجهرية في 10 حقول مجهرية ثم يستخرج العدد لكل 1مل من العينة.
الطريقة غير المباشرة (Indirect method)
وتتم باستخدام جهاز المطياف الضوئي (Spectrophotometer) وأن استخدام الطريقة غير المباشرة لتحديد العدد الكلي للأحياء المجهرية لا تتضمن حقيقة أعداد الأحياء المجهرية بل هو تحديد لوحدة الكتلة، وهذا ما نلاحظه في تحديد المستوى النيتروجيني أو قياس كمية الحامض النووي منزوع الأوكسجين (DNA) في المعلق البكتيري أو قياس مقدار الضوء الممتص باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
3- استخدام المطياف الضوئي لتحديد درجة العكورة
- تعتمد هذه الطريقة على قياس عكورة معلق الأحياء المجهرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي حيث يتم تحديد الضوء المار خلال العالق والمسلط ضمن طول موجي معين.
- عند مرور الضوء يعاني بعضه تشتتا لاصطدامه بجدران الخلايا بينما البعض الاخر يمر خلال العالق وهو الذي يتم قياسه بطرق تحديد العكورة.
- توجد علاقة خطية تربط تركيز الأحياء المجهرية ودرجة الامتصاص (الكثافة الضوئية).
2- تحديد الأعداد الحية Viable Count
قبل البدء بحساب أعداد الأحياء المجهرية، في جميع الطرائق المستخدمة يتم تخفيف العينة المراد حساب أعداد الأحياء المجهرية فيها باستخدام الأسي المتضاعف (العشري)، حيث تخفف العينة في الماء المقطر أو الوسط السائل أو المحلول الفسلجي، عندها تؤخذ 6 أنابيب اختبار وترقم بالتسلسل ويوضع في كل أنبوب 9 مل من محلول التخفيف ثم يمزج حجم 1 مل من المعلق البكتيري مع محتويات الأنبوب الأول إلى الثاني ويمزج الأنبوب الثاني جيداً وينقل حجم1 مل منه إلى الثالث ثم الرابع وهكذا، وأخيراً يزال حجم1 مل من الأنبوب الأخير ليكون الحجم في جميع الأنابيب متساوي.
ويمكن حساب الأعداد الحية المجهرية باستخدام الطرائق التالية:
- طريقة الصب في الأطباق (Pour Plate Method).
- طريقة التنمية السطحية (Surface Count Method).
- استعمال المرشحات الغذائية (Membrane filter Method).
