تحليل لطخة ويسترن (Western blot): هي تقنية تحليلية مخبرية، تُستخدم للكشف عن بروتين معين في عينة الدم أو الأنسجة، وتتضمن هذه الطريقة استخدام الفصل الكهربائي لفصل بروتينات العينة حسب الحجم، ثم نقل البروتينات المفصولة، ثم تمييز هذه البروتينات باستخدام أجسام مضادة أولية وثانوية.
خصائص تحليل لطخة ويسترن
يمتلك تحليل لطخة ويسترن الخصائص التالية:
- إن تحليل لطخة ويسترن تحليل يُستخدم بشكل واسع في البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة المناعية؛ وذلك لاكتشاف بروتينات معينة في عينة ما لتشخيص مرض معين مثل مرض الإيدز ومرض جنون البقر.
- يسمى تحليل لطخة ويسترن باللطخة المناعية للبروتين، وذلك لاستخدام أجسام مضادة في هذا التحليل.
- يوجد نوعين من تحليل لطخة ويسترن هما الفحص المباشر والفحص غير المباشر.
- يتضمن الفحص المباشر استخدام جسم مضاد أولي مترافق بالإنزيم أو الفلوروفور للكشف عن المستضد على البقعة، ولا يتم استخدام هذه الطريقة.
- يتضمن الفحص غير المباشر استخدام الجسم المضاد الأولي غير المُسمى للارتباط بمولد الضد، ثم يتم استخدام جسم مضاد أولي مترافق مع إنزيم أو جسم مضاد ثانوي مترافق مع فلوروفور.
- تستخدم تحليل لطخة ويسترن ثلاثة خطوات رئيسية هي: الفصل ثم النقل ثم تمييز البروتينات باستخدام أجسام مضادة أولية وثانوية.
- يتم فصل البروتينات وتحديدها، وذلك عن طريق فصل خليط من البروتينات بناءً على الوزن الجزيئي وحسب النوع، من خلال الفصل الكهربائي للهلام.
- تُنقل هذه النتائج إلى غشاء ينتج رباطاً لكل بروتين، ثم يتم تحضين الغشاء مع ملصقات الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف.
- يتم غسل الجسم المضاد غير المرتبط مع ترك الجسم المضاد المرتبط بالبروتين محل الاهتمام.
- بعد ذلك يتم الكشف عن الأجسام المضادة المرتبطة بتطوير الفيلم، ويجب أن يكون شريط واحد فقط مرئياً، ويكون سمك الشريط يتوافق مع كمية البروتين الموجودة، وبالتالي فإن إجراء معيار يمكن أن يشير إلى كمية البروتين الموجودة.
خطوات إجراء تحليل لطخة ويسترن
يتم إجراء تحليل لطخة ويسترن بالخطوات التالية:
1- الفصل الكهربائي للبروتينات
- الفصل الكهربائي للهلام (Gel electrophoresis): هي تقنية يتم فيها فصل الجزيئات المشحونة مثل البروتينات أو الحمض النووي اعتماداً على الخصائص الفيزيائية، حيث يتم دفعها عبر مادة هلامية بواسطة تيار كهربائي.
- تكون المادة الهلامية عبارة عن بولي أكريلاميد (PAGE)، التي تقوم بتحديد البروتينات الفردية في عينة معقدة أو بروتينات متعددة في عينة واحدة، وتعد PAGE أداة تحليلية قوية توفر معلومات عن كتلة البروتين أو شحنته أو نقاوته أو وجوده، وتوجد عدة أشكال منها، ويمكن أن تقدم أنواعاً مختلفة من المعلومات حول البروتينات المهمة.
- تفصل مادة PAGE غير المشبعة البروتينات وفقاً لنسب شحنة الكتلة.
- يفصل دوديسيل كبريتات الصوديوم أو SDS-PAGE البروتينات وفقاً للكتلة نفسها، بسبب الشحنة السالبة المنقولة على البروتينات المرتبطة بمنظف SDS الأيوني.
- تتوفر العديد من أنظمة التخزين المؤقتة أو الكيماويات الهلامية للفصل الكهربائي لهلام البروتين، ويوفر كل نظام مزايا فريدة عند حل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة.
2- نقل البروتينات إلى الغشاء
- بعد أن يتم فصل البروتينات بالهلام الكهربائي، يتم نقلها إلى غشاء صلب.
- يوجد نوعان من الأغشية التي يتم نقل البروتينات إليها: هي النيتروسليلوز (NC) أو بولي فينيلدين ديفلورايد (PVDF).
- يمتلك غشاء NC قابلية عالية لامتصاص البروتين والاحتفاظ به، ولكنه غشاء هش لا يسمح باستخدام اللطخة لإعادة الفحص، بينما يسمح غشاء PVDF بذلك، ويعتبر غشاء PVDF الأفضل لكنه أكثر تكلفة.
- يوجد العديد من الطرق التي يتم نقل البروتينات بها مثل النقل بالانتشار أو النقل بالتفريغ أو بالنقل الكهربائي، وإن النقل الكهربائي هي طريقة النقل الأكثر استخداماً للبروتينات؛ بسبب سرعتها وكفاءة النقل.
- يتضمن النقل الكهربي للبروتينات وضع هلام بولي أكريلاميد يحتوي على البروتين في اتصال مباشر مع قطعة من النيتروسليلوز أو أي غشاء آخر مرتبط بالبروتين بين قطبين في محلول موصل، ثم يتم استخدام ورق الترشيح، ثم يتم تطبيق مجال كهربائي يؤدي إلى تحرك البروتينات من هلام بولي أكريلاميد إلى سطح الغشاء، حيث تلتصق البروتينات بإحكام، فينتج عن ذلك غشاء به نسخة من نمط البروتين الذي كان في الأصل في هلام بولي أكريلاميد.
- يمكن أن تختلف كفاءة النقل بشكل كبير بين البروتينات، وذلك اعتماداً على قدرة البروتين على الانتقال من الهلام وميله إلى الارتباط بالغشاء في ظل مجموعة معينة من الظروف.
- تعتمد كفاءة النقل على عوامل مثل تكوين الهلام والتلامس الكامل للجل مع الغشاء وموضع الأقطاب الكهربائية ووقت النقل وحجم البروتينات وتكوينها وقوة المجال ووجود المنظفات والكحول في منطقة العازل.
- يوجد العديد من استراتيجيات النقل الكهربائي، وإن أكثر الطرق شيوعاً هي الطرق الرطبة وشبه الجافة والجافة، ويتطلب كل منها اعتبارات خاصة فيما يتعلق بالوقت والتكلفة والكواشف والأجهزة المطلوبة.
- توفر طريقة النقل الرطب كفاءة نقل عالية ومرونة في خيارات نظام العازلة والطريقة، ولكنها ذات وقت طويل وجهد كبير.
- توفر طريقة النقل شبه الجاف الراحة والوقت مع المرونة في استخدام أنواع متعددة من أنظمة التخزين المؤقت، ولكن يمكن أن يكون لهذه الطريقة كفاءة أقل في نقل البروتينات ذات الوزن الجزيئي الكبير أي أكبر من 300 كيلو دالتون.
- توفر طريقة النقل الجاف النقل عالي الجودة والسرعة والراحة، لأن المخازن المؤقتة ليست مطلوبة، ولكنها تتمتع بمرونة محدودة في المواد الاستهلاكية.
3- تلطيخ البروتين الكلي
- يمكن عمل تقييم للبروتين الكلي على الغشاء باستخدام بقعة بروتين للتحقق من كفاءة النقل، كما يمكن تلطيخ الجل للتأكد من انتقال البروتين من الهلام.
- يجب عمل تلطيخ للبروتين الكلي قبل عملية سد الغشاء.
- يوجد ما لا يقل عن سبع صبغات مختلفة لتلوين البروتين الكلي ومنها: صبغة (Ponceau S)، وصبغة (Sypro Rub Epicocconone)، وصبغة (Coomassie R-350)، وصبغة (Amido Black).
- يعد استخدام صبغة (Ponceau S) الأكثر استخداماً لتلطيخ البروتينات بشكل عكسي على الغشاء، على الرغم من أنها ذات حساسية محدودة، ولا تلطخ جيداً ويمكن أن تتلاشى بسرعة.
4- غسل تركيبات المنطقة العازلة
- إن خطوات الغسيل ضرورية لإزالة الكواشف غير المقيدة وتقليل الخلفية، وبالتالي زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
- قد يؤدي الغسل غير الكافي إلى خلفية عالية، بينما قد يؤدي الغسل المفرط إلى انخفاض الحساسية الناتجة عن شطف الجسم المضاد، أو المستضد من البقعة.
- يعتبر المحلول الملحي Tris-buffered saline (TBS) والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) أكثر مخازن الغسيل المؤقتة استخداماً.
- يمكن أن يكون محلول PBS و TBS قابل للتبديل، فيجب استخدام TBS عند استخدام أنظمة تحتوي على أجسام مضادة ثانوية مترافقة مع الفوسفاتيز القلوي (AP) أو عند اكتشاف البروتينات المُفسفرة بأجسام مضادة خاصة بالفوسفات.
- تتكون تركيبات محلول الغسيل من منظف؛ للمساعدة في إزالة المواد غير المرتبطة بشكل خاص.
- يمكن أن محاليل تعزز نمو الميكروبات، لذلك يجب عمل مخزون مخفف مسبقاً من المنظفات مثل NP-40 و CHAPS و Tween 20، ويمكن أن تنمو الفطريات في هذه المحاليل، مما قد يؤدي إلى ضوضاء خلفية عالية.
- يمكن أن تحتوي المنظفات على كميات كبيرة من البيروكسيدات التي ستسبب إشارة خلفية عند استخدام ركائز البيروكسيداز الفجل، لذلك من المهم استخدام منظفات عالية النقاء.
- يتم عمل فحص للغشاء بحثاً عن البروتين المطلوب باستخدام جسم مضاد معدل ومرتبط بإنزيم مراسل ، وعند تعرضه لركيزة مناسبة، يؤدي هذا الإنزيم إلى تفاعل لوني وينتج لوناً.
5- استخدام الأجسام المضادة
- يعتمد اختيار الجسم المضاد الأولي على مولد الضد المراد اكتشافه والأجسام المضادة المتاحة لهذا المستضد، وليست كل الأجسام المضادة الأولية مناسبة لهذا التحليل.
- لا يمكن اكتشاف الجسم المضاد الأولي الذي يتعرف على البروتين المستهدف في لطخة غربية بشكل مباشر، ولذلك يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المميزة كوسيلة للكشف النهائي عن المستضد المستهدف.
- يعتمد اختيار الجسم المضاد الثانوي على نوع الحيوان الذي تم فيه رفع الجسم المضاد الأولي (النوع المضيف) أو أي علامة مرتبطة بالجسم المضاد الأولي.
- تتطلب أنظمة الكشف الأكثر حساسية أجساماً مضادة أقل من أنظمة الحساسية الأقل، ويمكن أن تؤدي إلى توفير كبير في تكاليف الجسم المضاد وتسمح بإطالة كمية محدودة من الجسم المضاد عبر تجارب أكثر.
- يمكن أن يكون لاستخدام كميات أقل من الجسم المضاد فائدة إضافية تتمثل في تقليل الخلفية.
