اقرأ في هذا المقال
ما هو مفهوم التعداد الخلوي:
غالبًا ما يكون عد الخلايا خطوة ضرورية ولكنها مملة لزراعة الخلايا المختبرية، إذ تضمن تركيزات الخلايا المتسقة إمكانية التكاثر التجريبي والدقة، ويعد تعداد الخلايا مهمًا لمراقبة صحة الخلايا ومعدل الانتشار وتقييم الخلود أو التحول وبذر الخلايا للتجارب اللاحقة وانتقال العدوى والتحضير للمقايسات القائمة على الخلايا، حيث من المهم أن يكون عدد الخلايا دقيقًا ومتسقًا وسريعًا لا سيما بالنسبة للقياسات الكمية للاستجابات الخلوية.
على الرغم من هذه الحاجة إلى السرعة والدقة في تعداد الخلايا، فإن 71٪ من 400 باحث شملهم الاستطلاع قاموا بعدّ الخلايا باستخدام مقياس الكريات، حيث في حين أن قياس الدم غير مكلف إلا أنه شاق ويخضع لتحيز المستخدم وسوء الاستخدام، مما يؤدي إلى إحصائيات غير دقيقة، إذ أن أجهزة قياس الدم مصنوعة من زجاج بصري خاص يتم تحميل المعلقات الخلوية عليه بأحجام محددة ويتم عدها تحت المجهر.
تشمل مصادر الأخطاء في قياس الكريات الدموية: التوزيع غير المتكافئ للخلايا في العينة أو وجود عدد كبير جدًا أو قليل جدًا من الخلايا في العينة والقرارات الذاتية بشأن ما إذا كانت خلية معينة تقع ضمن منطقة العد المحددة، وتلوث مقياس الكريات والتباين من مستخدم إلى مستخدم والاختلاف في معدل ملء عدادة الكريات.
للتخفيف من الملل المرتبط بالعد اليدوي يقوم 29٪ من الباحثين بعد الخلايا باستخدام أجهزة عد الخلايا الآلية، وتشمل هذه العدادات القائمة على الرؤية، والأنظمة التي تكتشف الخلايا باستخدام مبدأ كولتر أو قياس التدفق الخلوي، وبالنسبة لمعظم الباحثين يتمثل العائق الرئيسي لاستخدام نظام آلي في السعر المرتبط بهذه الأدوات الكبيرة التي توضع على الطاولة.
يعد عداد خلية (scepter) جهازًا آليًا محمولًا يوفر أتمتة ودقة عد(Coulter) بتكلفة منخفضة نسبيًا، إذ يستخدم النظام مبدأ كولتر الخاص باكتشاف الجسيمات القائم على الممانعة، وبتنسيق مصغر باستخدام مزيج من الأجهزة التناظرية والرقمية للاستشعار ومعالجة الإشارات وتخزين البيانات والعرض الرسومي، كما تم تصميم الطرف القابل للاستعمال مرة واحدة مع منطقة استشعار خلية دقيقة التصنيع والتي تتيح التمييز حسب حجم الخلية وحجم الخلية بدقة أقل من ميكرون وشبه بيكولتر، مُحسّنًا بقنوات معالجة السوائل الدقيقة والإلكترونيات ويعرض عداد خلية صولجان إحصاءات عدد الخلايا المعروضة بيانياً كرسم بياني.
أهمية عد الخلايا:
يعد تعداد الخلايا خطوة ضرورية ولكنها مملة لزراعة الخلايا في المختبر، وتضمن تركيزات الخلايا المتسقة إمكانية التكاثر التجريبي والدقة، وتتضمن مصادر الخطأ في قياس الدم: التوزيع غير المتكافئ للخلايا في العينة أو وجود عدد كبير جدًا أو قليل جدًا من الخلايا في العينة والقرارات الذاتية، بشأن ما إذا كانت خلية معينة تقع ضمن منطقة العد المحددة وتلوث مقياس الكريات والتباين بين المستخدمين، والاختلاف في معدل ملء عدادة الكريات.
بالنسبة لغالبية عمليات التلاعب باستخدام خطوط الخلايا مثل عمليات التحويل وتقنيات اندماج الخلايا والحفظ بالتبريد وإجراءات الثقافة الفرعية من الضروري تحديد عدد الخلايا قبل الاستخدام، حيث سيحافظ استخدام عدد ثابت من الخلايا على النمو الأمثل، ويساعد أيضًا في توحيد الإجراءات باستخدام مزارع الخلايا وهذا بدوره يعطي نتائج أفضل للتكاثر.
تحضير تعليق أحادي الخلية للعد:
لاستخدام عداد خلية الصولجان ابدأ بتخفيف تعليق خلية مفردة من الخلايا في محلول ملحي مخزّن من الفوسفات، حيث أن تركيز 10000-500000 خلية لكل مل هو الأمثل، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة إلى أنبوب ميكروفيج 1.5 مل، ثم إجراء عد الخلايا باستخدام الصولجان،نقم بتشغيل عداد خلية صولجان عن طريق الضغط مع الاستمرار على زر التبديل الموجود في الجزء الخلفي من الأداة وانتظار ظهور الإرشادات التي تظهر على الشاشة، حيث عند المطالبة نقم بتوصيل جهاز استشعار بنهاية وحدة الصولجان مع توجيه لوحة استشعار القطب نحو مقدمة الجهاز.
تتكون مستشعرات الصولجان من غرفة أخذ عينات مصبوبة بدقة مع منطقة استشعار إلكترونية وأقطاب كهربائية لاستشعار الخلية، إذ تتيح المستشعرات التمييز بين حجم الخلية بدقة أقل من ميكرون وحجم الخلية بدقة شبه بيكولتر، إن هندسة مستشعر متسقة تضمن حساب أحجام العينات المتساوية وإجراء قياسات دقيقة للحجم، وبمجرد توصيل المستشعر نقم بتنفيذ كل خطوة من خطوات عملية العد وفقًا للتعليمات التي تظهر على الشاشة كما يلي:
عندما نقرأ الشاشة “اضغط على المكبس للبدء” نضغط على المكبس، إذ سنقرأ الشاشة بعد ذلك نغمر المستشعر في محلول تعليق الخلية ونطلق المكبس لنضح تعليق الخلية في المستشعر، حيث يعمل المكبس كإشارة كهربائية وسيسحب العينة بالإضافة إلى الحجم الميت إلى المستشعر، ولا تهم سرعة أو دقة الغمر كما هو الحال مع المص، ستستغرق هذه العملية عدة ثوان، وعندما نكون جاهزين ستصدر الأداة صفيرًا وسيتم عرض “تم تحميل العينة” على الشاشة.
بمجرد تحميل العينة في المستشعر يتم سحبها عبر منطقة الاستشعار لتقييم حجم الخلية وحجم الخلية ثم من خلال القنوات الدقيقة بمجرد حساب 50 ميكرولتر من العينة يخبر المستشعر الجهاز بالتوقف عن العد، وبعد اكتمال العد ستظهر شاشة الأداة “اكتمل العد، الرجاء إزالة المستشعر والتجاهل” نتبع التعليمات ونقم بإزالة المستشعر وتجاهله، إذ ستعرض الأداة بعد ذلك رسمًا بيانيًا لحجم الخلية أو قطرها على شاشتها بالإضافة إلى تركيز الخلية لكل مل.
عند إحضار الخلايا الملتصقة وشبه الملتصقة إلى التعليق باستخدام التربسين وأعداد التعليق في حجم وسط جديد يعادل على الأقل حجم التربسين، للخلايا التي تنمو في كتل الطرد المركزي واعادة تعليقها في حجم صغير والماصة برفق لتفتيت الكتل، وتحت ظروف معقمة إزالة 100-200 ميكرولتر من تعليق الخلية، يتم إضافة حجمًا متساويًا من(Trypan Blue) (عامل التخفيف = 2) وخلطه بواسطة ماصات لطيفة، وتنظيف جهاز قياس الكريات، يتم بلل الغطاء بالماء أو الزفير، وتحريك الغطاء على الحجرة ذهابًا وإيابًا باستخدام ضغط خفيف حتى تظهر حلقات انكسار نيوتن (يُنظر إلى حلقات انكسار نيوتن على أنها حلقات تشبه قوس قزح تحت الغطاء).
يتم ملء كلا الجانبين من الغرفة مع تعليق الخلية (حوالي 5-10 مايكرولتر) وعرض تحت مجهر تباين الطور المقلوب باستخدام التكبير x20، عند حساب عدد الخلايا القابلة للحياة (التي تُرى كخلايا ساطعة) والخلايا غير القابلة للحياة (باللون الأزرق الملون)، حيث من الناحية المثالية يجب عد أكثر من 100 خلية من أجل زيادة دقة عدد الخلايا، يلاحظ عدد المربعات التي تم حسابها للحصول على العدد> 100.
تحليل البيانات:
بعد اكتمال العد وعرض الرسم البياني على الأداة نقم بتطبيق البوابات عن طريق الضغط على زر التبديل حدد “البوابة التلقائية” أو “استخدام الأخير” إما لتعيين البوابة تلقائيًا بناءً على ملف تعريف الرسم البياني أو لاستخدام البوابات من العد السابق، وبغض النظر عن التحديد يمكن نقل البوابات يدويًا لضبط البيانات بدقة، نضغط على زر التبديل مرة أخرى لتحديد البوابة اليسرى ونقم بتمرير زر التبديل لتحريك البوابة حسب الرغبة، ثم نضغط على مفتاح التبديل مرة أخرى لتنشيط البوابة اليمنى وننتقل إلى مفتاح التبديل لوضع البوابة اليمنى.
عن النقر مرة أخرى سيتم عرض تركيز خلية جديدة ومتوسط حجم الخلية وقطرها، حيث يمكن أيضًا نقل التبديل إلى أي من الجانبين لتبديل العرض بين التاريخ والوقت ومتوسط حجم الخلية وحجم الخلية المتوسط، كما يمكن تخزين ما يصل إلى 72 رسمًا بيانيًا على الأداة نفسها، ولتحميل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي نقم بتوصيل الأداة عبر منفذ كابل USB الموجود على شاشة العرض على جهاز الكمبيوتر وننقر نقرًا مزدوجًا فوق تطبيق برنامج (Scepter) لتشغيل البرنامج ثم النقر فوق “اتصال” سيتم نقل جميع التهم تلقائيًا إلى البرنامج.
يعرض برنامج تطبيق (Scepter) الرسم البياني الذي يوضح بالتفصيل توزيع السكان للثقافة في الحجم أو القطر، إذ يمكن بعد ذلك تصدير الملفات التي تم تنزيلها إلى (Microsoft Excel)، حيث سيتم عرض البيانات الأولية في سلال بأقطار خلية أو أحجام خلايا محددة.
هناك عدة مصادر لعدم الدقة: وجود فقاعات هواء وفتات في الغرفة فرط ملء الغرفة بحيث تصل العينة إلى القنوات أو الغرفة الأخرى عدم اكتمال ملء خلايا الغرفة غير الموزعة بالتساوي في جميع أنحاء الغرفة عدد الخلايا قليل جدًا للعد، إذ يمكن التغلب على هذا عن طريق الطرد المركزي للخلايا وإعادة التعليق في حجم أصغر وإعادة الفرز عدد الخلايا كبير جدًا ليتم عدها.
كما يمكن التغلب على ذلك باستخدام عامل تخفيف أعلى في أزرق تريبان على سبيل المثال 1:10 5، حيث يمكن أن يكون استخدام مقياس الكريات الدموي مضيعة للوقت وعرضة للأحكام الذاتية من قبل المشغل وبعض أنواع الخلايا مثل تلك التي تشكل مجموعات، ويصعب حسابها بشكل خاص باستخدام هذه الطريقة، حيث تتوفر معدات عد الخلايا التي توفر طرقًا بديلة لتقدير الخلايا بما في ذلك (Scepter Cell Counter)، يتيح محلل الخلايا إجراء تقييم يعتمد على قياس التدفق الخلوي لعدد الخلايا والقدرة على البقاء.
