تجزئة الحمض النووي:
يعتبر تجزئة الحمض النووي حدثًا مميزًا عندما تموت الخلية، طريقة شائعة الاستخدام للكشف عن فواصل حبلا (DNA) هي مقايسة (TUNEL) وسم نهاية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (dUTP)، إذ يتم تطبيق هذه التقنية على الأقسام النسيجية التي تسمح للمستخدم ليس فقط التأكد مما إذا كان تجزئة الحمض النووي قد حدث والذي يمكن تحديده أيضًا من خلال الفصل الكهربائي للهلام، ولكن لمراقبة الخلايا المحددة التي تحتوي على الحمض النووي المجزأ.
يُعتقد تقليديًا أن تجزئة الحمض النووي كما تم قياسه بواسطة اختبار (TUNEL) كمؤشر على موت الخلايا المبرمج ومع ذلك يمكن لكل من الخلايا المبرمج والنخرية أن تلطخ بشكل إيجابي باستخدام (TUNEL)، لذلك تعتبر (TUNEL) علامة على موت الخلايا ولكن ليس بالضرورة على موت الخلايا المبرمج على وجه التحديد.
يتم استخدام ترانسفيراز ديوكسينوكليوتيديل الطرفي (TdT) لدمج (dUTP) المعالج بالبيوتين في نهايات (3′-OH) للحمض النووي التي تتعرض أثناء انقسام الحمض النووي، وبمجرد وضع علامة عليها تقوم حضانة ثانية بتضخيم الإشارة، مما يؤدي إلى تغيير اللون أو التألق، إذ يمكن تصور الخلايا المصنفة بواسطة الفحص المجهري الضوئي أو الفلوري اعتمادًا على الجزيء المستخدم في الحضانة النهائية.
يمكن أن يكون تجزئة الحمض النووي والتكثيف النووي من سمات موت الخلايا المبرمج المتأخر، حيث يؤدي تنشيط بروتين كاسباس إلى تنشيط نوكلياز خلايا الخميرة مثل عامل تجزئة الحمض النووي (DFF40) في الثدييات، إذ ينقسم الحمض النووي للكروماتين أثناء موت الخلايا المبرمج إلى أجزاء قصيرة بواسطة نوكليازات داخلية نشطة ويقع في هامش النوى.
قياسات (TUNEL) في تجزئة الحمض النووي:
طريقة (TUNEL) هي طريقة سريعة وحساسة لتصور تجزئة الحمض النووي في الخلايا الفردية باستخدام الفحص المجهري الفلوري، في خلايا الخميرة لوحظت الأنماط الظاهرية الأبوطوزية إيجابية (TUNEL) باستخدام مجهر مضان، مما يشير إلى تجزئة الحمض النووي والهوامش.
استخدمت العديد من الدراسات (TUNEL) لتقييم جودة جزيرة استجابة للإجهاد أو العلاج، إذ إنها أداة بحث قيمة لمراقبة الخلايا المحددة التي تمر بعملية موت الخلية، ونظرًا لأن (TUNEL) تتطلب أخذ العينات النسيجية وتحضيرها وتلطيخها، فمن المفيد استخدامها بأثر رجعي بدلاً من التقييم المستقبلي لإعداد جزيرة قبل الزرع.
على الرغم من استخدام (TUNEL) عادةً في الأقسام النسيجية في أبحاث الجزيرة، إلا أنه يمكن أيضًا قياسها باستخدام خلايا مفردة ثابتة ومشتتة مع قياس التدفق الخلوي، ولكن مع العيوب المرتبطة باستخدام الخلايا المفردة التي تم الحصول عليها من تفكك الجزر.
قد توفر قياسات التغييرات المحددة التي تحدث أثناء موت الخلايا المبرمج نظرة ثاقبة مهمة حول قابلية تحضيرات الجزيرة، ويمكن استخدام تقنيات مختلفة مع أقسام نسيجية أو خلايا مفردة من جزر منفصلة أو جزر سليمة، تتطلب الاختبارات التي تتطلب أقسامًا نسيجية مثل اختبار (TUNEL) ونوع واحد من مقايسة كاسباس وقتًا طويلاً، وبالتالي فهي غير مناسبة للتحليل السريع، ولكنها قد تكون مفيدة لتحليل ما بعد الزرع لأنه يمكن تحديد الخلايا التي يحدث فيها موت الخلايا المبرمج.
الاختبارات التي تستخدم خلايا الجزيرة المنفصلة مشكوك فيها لأن جزءًا كبيرًا من الخلايا يُفقد أو يتلف أثناء تفكك الجزر مما يجعل أنكسين V و(TUNEL) عن طريق قياس التدفق الخلوي عرضة للتأثير، حيث تعد المقايسات التي تبدأ بالجزر السليمة مفيدة للقياس السريع لأنه لا يلزم إعداد كبير للتحليل.
نتيجة لذلك فإن فحص النواة الشكل الثاني من مقايسة كاسباس و(HRMAS 1H NMR) جذابة لتقييم جودة الجزيرة، ومن بين هذه المقايسات الثلاثة قد يكون اختبار كاسباس هو المؤشر الأكثر فائدة لموت الخلايا المبرمج في حد ذاته، إذ يكتشف فحص النيوكليوسوم تجزئة الحمض النووي التي تحدث في كل من الخلايا الميتة والخلايا الأبوطوزية.
على هذا النحو فهو مؤشر أفضل لجميع الخلايا التي تموت بسبب موت الخلايا المبرمج والنخر، كما أن (HRMAS 1H NMR) لديه القدرة على أن يكون مفيدًا لكنه يتطلب معدات متخصصة، وبالتالي قد يكون غير جذاب للمؤسسات الصغيرة التي لا تملك الموارد.
طرق كشف تجزئة الحمض النووي:
غالبًا ما يتم تحديد تجزئة الحمض النووي التي لطالما اعتبرت سمة مميزة لموت الخلايا المبرمج عن طريق تحديد سلم الحمض النووي 200 زوج قاعدي مع الرحلان الكهربائي للهلام، ومؤخرًا عن طريق مجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم بناءً على الأجسام المضادة لمجمعات هيستون (DNA).
ومع ذلك فإن هذه الأساليب ليست كمية أي لا يمكن تحديد النسبة المئوية للخلايا التي تخضع بالفعل لموت الخلايا المبرمج في المجموعة السكانية التي يتم فحصها وتعطي فقط تقديرًا نوعيًا تقريبيًا في أحسن الأحوال، إن الطريقة الكمية البديلة هي تلطيخ الحمض النووي في الخلايا الثابتة بالإيثانول، ثم تحليل محتوى الحمض النووي عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأصباغ الفلورية مثل يوديد البروبيديوم التي تقحم في الحمض النووي، إذ في هذا النهج تتميز الخلايا المبرمجة بمحتوى منخفض من الحمض النووي (sub-G1) مقارنة بالخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية.
