تقنية تهجين الحمض النووي:
يعد تهجين الحمض النووي أحد أقوى التقنيات المطبقة في المقايسات التشخيصية، حيث توفر الموائع الدقيقة وسيلة واعدة لتحليل أحجام العينات الصغيرة وتقليل استهلاك الكاشف والتكلفة وتقصير وقت المعالجة، بالإضافة إلى تطوير أدوات تشخيص سريعة وحساسة ومحمولة.
من خلال الاقتران بتقنية ميكروفلويديك يمكن أن يحقق اختبار تهجين الحمض النووي حساسية عالية ويعزز حركيات التهجين ويقلل ارتباط مسبار الهدف غير المحدد، إذ تتمتع تقنية تهجين الحمض النووي القائمة على الموائع الدقيقة بإمكانية كبيرة لتطوير أجهزة تشخيص منخفضة التكلفة وسريعة وتلقائية ونقاط الرعاية.
يتم قياس العلاجات التي تعتمد على القليل من النوكليوتيد مع فحوصات التهجين في المصفوفات البيولوجية مثل البلازما والأنسجة، حيث لا تميز طرق التهجين الحالية تمامًا المركب الأصلي من مستقلبات مقطوعة، وكانت النتائج انه تم تطوير اختبار تهجين مزدوج قائم على الربط للتحايل على قيود تنسيقات الفحص الحالية.
يتم إجراء ربط المجسات في أي من طرفي التحليل عبر تفاعل ثنائي الأنزيم يتكون من عديد النوكليوتيد كيناز و(DNA ligase)، وتم التحقق من صحة الطريقة فيما يتعلق بالآلية والنوعية والدقة، حيث تم التوصل الى أن اختبار الربط المزدوج خاص بالمركب الأم ويكشف عن المنتج كامل الطول بنهايات سليمة، ويمكن أيضًا استخدام اختبار الربط المزدوج لتحديد المستقلبات الفردية على وجه التحديد في الخلائط المعقدة، ويتم تنفيذه حاليًا على (PCR) الكمي.
تعتبر المؤشرات الحيوية مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين أدوات قوية لفهم الوظائف الخلوية الأساسية وتشخيص الأمراض السريرية وتحديد العلاجات المثلى، وعلى وجه الخصوص يعد (RNA) مؤشرًا مثاليًا للتغيرات الديناميكية في التعبير الجيني التي تحدث في الكائن الحي، ويلتقط التعبير الجيني في الموقع على مستوى خلية واحدة، والتي يمكن تصورها داخل الأنسجة السليمة الكشف الجزيئي في سياق مورفولوجي لفهم التفاعلات بين الخلية بشكل أفضل.
التحليل الكمي للجزيئات الحيوية:
يعد القياس الكمي الدقيق والدقيق للجزيئات الحيوية مثل الاختلافات في عدد نسخ الجينات (CNV) ومستوى مثيلة الحمض النووي والتعبير الجيني أمرًا ضروريًا للبحوث الطبية الحيوية الأساسية وكذلك التطبيقات التشخيصية، وتحقيقا لهذه الغاية تم تطوير العديد من المقايسات الرقمية لتكملة المقاسات التناظرية التقليدية.
تم تطوير تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (PCR) و(ELISA9) الرقمي للتقدير الكمي المطلق لجزيئات الحمض النووي المفردة وجزيئات البروتين المفردة دون الحاجة إلى منحنى قياسي، وعلى الرغم من أن التقدير الكمي للحمض النووي الريبي الترميز وغير المشفر أمر مرغوب فيه للغاية أيضًا في العديد من التطبيقات مثل اختبارات الحمل الفيروسي وتعبير نسخ الحمض النووي الريبي وتنميط الحمض النووي الريبي، فإن الاختبارات الرقمية لتقديرات الحمض النووي الريبي المطلقة تظل أقل استكشافًا.
تعتمد طريقة القياس الكمي الأكثر انتشارًا للحمض النووي الريبي على النسخ العكسي من تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل (RT-qPCR)، حيث يقوم النسخ العكسي أولاً بتحويل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) قبل تضخيم (cDNA) ومراقبته في الوقت الحقيقي بالترتيب لإجراء التحليل الكمي بعد التضخيم.
على الرغم من أن (PCR) الرقمي قادر على تعداد أهداف الحمض النووي الريبي النادرة في خطوة واحدة عند دمجها مع عملية النسخ العكسي، فمن المعروف أن عملية النسخ العكسي الأنزيمية غير الخطية تقدم تحيزًا كميًا، وفي هذا الصدد قد توفر الطريقة القائمة على النسخ غير العكسي بديلاً أفضل لتقدير الحمض النووي الريبي.
نظرًا لطبيعته الأحادية الجديلة فإن التهجين الخطي متاح بسهولة لجزيئات الحمض النووي الريبي، في حين أن القياس الكمي في فحوصات التهجين التقليدية على سبيل المثال المصفوفات الدقيقة عادة ما يكون شبه كمي وأقل حساسية، إذ يمكن أن ينتج عن إصدار رقمي من التحليل القائم على التهجين تقديرًا كميًا مطلقًا وحساسية عالية جدًا في وقت واحد.
على سبيل المثال (Walt and Duffy et al) نجحوا في تنفيذ النهج القائمة على إنزيم واحد للتقدير الكمي المطلق للحمض النووي الجيني البكتيري، وقادت الأعمال الرائدة في المقايسات الرقمية المستندة إلى إنزيم واحد إلى استكشاف إمكانية استخدام التهجين الخطي لاكتشاف الحمض النووي الريبي الرقمي والقياس الكمي.
مقايسة تهجين أليغنوكليوتيد رقمية ذات تدفق مستمر مرتبط بالإنزيم (قطرات ELOHA الرقمية) قادرة على القياس الكمي المطلق لجزيئات الحمض النووي الريبي ذات الحساسية العالية، ويشتمل (قطرات ELOHA الرقمية) على التهجين المباشر وتفاعلات الإنزيم الفردي، مما يتيح اكتشاف الحمض النووي الريبي الرقمي الخالي من النسخ العكسي.
على وجه التحديد يُسمح لأول مرة بأهداف الحمض النووي الريبي (RNA) لتهجين مجسات التقاط الحمض النووي التي تم اقترانها بالخرز المغناطيسي، ويتبع ذلك تهجين إلى تحقيقات الكشف عن الحمض النووي أحادي الجديلة المسمى بالإنزيم، ويتم بعد ذلك تغليف الحبيبات المغناطيسية في عدد كبير من القطرات مختلطة مع ركيزة الإنزيم واحتضانها واكتشافها مباشرة في شريحة واحدة متكاملة موائع جزيئية.
