تريسفوسفات الإينوزيتول:
أن تحديد كمية تريسفوسفات الإينوزيتول عن طريق التحليل الكمي للإينوزيتول يتطلب إزالة شقوق الفوسفات من حلقة السيكلتول، حيث يمكن تحقيق نزع الفسفرة من (IP3) عن طريق نزع الفسفرة الأنزيمية باستخدام الفوسفاتاز القلوي.
يتطلب هذا الإجراء إزالة العينات في محلول ملحي يفضي إلى نشاط الفوسفاتيز القلوي، ولسوء الحظ تتداخل هذه الحلول بشكل متكرر مع اشتقاق الإينوزيتول لـ (GC) وبالتالي يجب إزالتها عن طريق تحلية كروماتوجرافيا.
نزع الفسفرة:
أثناء قياس الطيف الكتلي بالحرارة تم نزع الفسفرة بسرعة من المحاليل المائية من أحادي فوسفات الإينوزيتول وفوسفات الإينوزيتول عند التعرض القصير لدرجات حرارة تصل إلى 200 درجة مئوية، لذلك تم استخدام هذا النهج كطريقة جديدة لإزالة الفسفرة غير الأنزيمية، والتي تتضمن تسخين عينات مائية إلى 200 درجة مئوية في أنبوب زجاجي مغلق.
من الضروري تحويل الأنابيب الزجاجية إلى سيلنة شاملة لإزالة الفسفرة لتجنب الخسائر الفادحة في المادة التحليلية، حيث يتم عزل الأنابيب على النحو التالي: المقاطع مقاس 7 سم من 4-5 مم أنابيب زجاجية بورو سيليكات محكمة الغلق بالحرارة في أحد طرفيها، ويتم غسلها بتغييرات 2-3 من الميثانول، وتجفيفها بالهواء.
يتم تنفيذ السيلنة عن طريق نقع الأنابيب في 7٪ ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان في التولوين لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ثم صب وتسخين الأنابيب عند 200 درجة مئوية حتى تجف (5-10 دقائق) ثم التبريد، حيث يضمن هذا الإجراء عند تكراره 2-3 مرات طلاءً مناسبًا لسطح الزجاج التفاعلي بحيث يتم تحقيق استرداد الإينوزيتول بنسبة 80-90٪.
بالنسبة لنزع الفسفرة يتم حل المستخلصات المجففة بالتجميد والمحلاة في 500 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج، حيث يتم حساب 50 ميكرولتر من قسامات لتقييم الاسترداد، ويتم نقل 50 إلى 100 ميكرولتر إلى الأنابيب السيلانية للتحلل المائي.
يتم بعد ذلك إغلاق أسطح الأنابيب بالحرارة ويتم تسخين العينات عند 200 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في حمام رملي في فرن تمت معايرته إلى 200 درجة مئوية، وبعد التبريد يتم فتح الأنابيب وتبخر العينات حتى تجف في مبخر طرد مركزي (Savant). في ظل هذه الظروف يتم نزع الفسفرة من (IP3) تمامًا إلى الإينوزيتول، كما يتضح من إعادة الكروماتوغرافيا لعينة ساخنة تحتوي على [3H] (IP3)، علاوة على ذلك يتم استرداد(IP3) المحضر تجاريًا (Sigma) كميًا باعتباره ميو-إينوزيتول.
يبدو أن الفوسفات المتبقي في العينة ليس له أي تأثير على اشتقاق أو تقدير كمية الإينوزيتول، وفي الواقع إضافة 100 (pmol) من الفوسفات أو 10 (pmol) من (ATP) الملوث الأكثر احتمالا من عينات الأنسجة إلى معايير إينوزيتول ليس له أي تأثير على الكميات.
فسفوليباز سي:
يتم تقسيم فوسفات الإينوزيتول إلى تريسفوسفات الإينوزيتول و (diacylglycerol) بواسطة عائلة الإنزيمات phospholipase) C)، حيث تتكون عائلة إنزيم فسفوليباز سي من عدد من الأنواع الفرعية.
المسارات التي يتم تنشيطها بواسطة أي من الإنزيمين متشابهة تمامًا، حيث يتم تنشيط بعضها مثل إنزيمات فسفوليباز (Cβ) بواسطة الوحدات الفرعية للبروتين (G α)، في حين يتم تنشيط الفوسفوليباز C بواسطة الوحدات الفرعية للبروتين G أو بواسطة عوامل النمو.
يرتبط ثلاثي فوسفات 1،3،5-إينوزيتول الناتج عن انهيار فوسفاتيديل إينوزيتول بمستقبلات داخل الخلايا ويفصل أو يزيد الكالسيوم داخل الخلايا، (Diacylglycerol) هو أيضًا أحد منتجات تحلل إنزيمات (phospholipase Cβ)، وينشط (diacylglycerol) في وجود الكالسيوم (PKC).
يتم تنشيط (Phospholipase C) بواسطة الوحدات الفرعية للبروتين (G α)، وتحديداً (Gq و G11) بينما يتم تنشيط (phospholipase Cβγ) بواسطة الوحدات الفرعية للبروتين (G. Gq) و (G11) عبارة عن بروتينات G غير حساسة للسعال الديكي وسموم الكوليرا.
وبالتالي فإن التنشيط المعتمد على البروتين G لـ (phospholipase Cβ) غير حساس للاضطراب بسبب السموم البكتيرية ومع ذلك، إذا تم تنشيط (phospholipase Cγ) بواسطة وحدات فرعية فيجب تنشيط Gα الذي يحتفظ بالوحدات الفرعية بواسطة (GPCR) استجابة للناهض، وهذه العملية حساسة لسموم السعال الديكي عندما يقترن (Gi أو Go) بالمستقبل المنشط.
تنشيط (PLC) يولد دياسيل جلسرين (DAG) وثلاثي فوسفات إينوزيتول (Ins (1،4،5) P3) على عكس العديد من الخلايا يمكن أيضًا تنشيط جزيرة (PLC) مباشرة بواسطة (Ca)، وهكذا في تحضير الغشاء المعزول أدى رفع تركيز(Ca2 +) من 1 إلى 10 ميكرومتر إلى زيادة معنوية في نشاط الإنزيم.
يشير هذا إلى احتمال أن الإنزيم لا يمكن تنشيطه فقط عن طريق تفاعل مستقبل الإشارة ولكن أيضًا عن طريق التغييرات في تركيز (Ca2 +) العصاري الخلوي أي استجابة لإزالة الاستقطاب وتدفق (Ca2 +) اللاحق ومع ذلك لا يزال الدليل التجريبي على ذلك مثيرًا للجدل.
