التهجين الموضعي

مفهوم التهجين الموضعي:

يتيح التهجين في الموقع الكشف والتوطين الدقيق لتسلسل حمض نووي معين داخل خلية فردية، حيث يرتبط تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد في قسم الأنسجة عن طريق الاقتران القاعدي التكميلي؛ أي التهجين مع جزء من الحمض النووي يمكن اكتشافه يسمى المسبار.

يجمع التهجين في الموقع (ISH) بين ثلاث مزايا رئيسية: الحساسية الكبيرة والتوطين التشريحي الدقيق وإمكانية القياس الكمي، إن تقنيات النشاف شائعة الاستخدام للكشف عن الحمض النووي بعد تجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي والتهجين لا تحدد الخلية التي تحتوي على الحمض النووي ولا تحديد موقعها الدقيق في الأنسجة، وعلاوة على ذلك قد تكون طرق النشاف أقل حساسية: إذا كانت هناك خلايا قليلة فقط تعبر عن كمية كافية من الحمض النووي فقد لا يتم اكتشافها عن طريق النشاف بعد تجانس الأنسجة بينما ستكون بواسطة (ISH) خاصة في الأنسجة غير المتجانسة مثل الدماغ، ويبدو أن (ISH) هي الطريقة المفضلة للكشف عن الأحماض النووية وتحديد موقعها وتحديدها كمياً.

التطبيقات الرئيسية للتهجين في الموقع:

أحد التطبيقات الرئيسية لـ (ISH) هو اكتشاف جزيئات معينة من حمض الريبونوكليك (mRNA)، حيث يسمح (ISH) بالتوطين الدقيق لموقع تخليق الببتيد، كما يسمح (ISH) جنبًا إلى جنب مع الكيمياء الخلوية المناعية (ICC) بالتمييز بين موقع التخليق الحيوي (ISH و ICC إيجابي) والتخزين أو الامتصاص (إيجابي ICC فقط)، والتطبيق الرئيسي الثاني هو دراسة الحالة الوظيفية للخلايا، إذ يمكن أن تكون التغييرات في التعبير الجيني في المواقف المرضية أو بعد التلاعبات الفسيولوجية أو الدوائية شبه جزئية، ويمكن أيضًا إجراء دراسات تنموية حول بداية التعبير الجيني والتنظيم.

يتكون بروتوكول التهجين في الموقع من عدة خطوات مترابطة، حيث يجب أن يحافظ تحضير الأنسجة أي أخذ العينات والتجزئة والتثبيت على التشكل وكذلك نفاذية المسبار ويجب أن يمنع فقدان الأحماض النووية، كما يجب اختيار المجسات وتصنيفها لتشكيل هجينة محددة ومستقرة ويمكن اكتشافها بسهولة، ويجب تحديد ظروف التهجين المثلى (تكوين الوسط ودرجة الحرارة والقوة الأيونية وتركيز المسبار والمدة وغسيل ما بعد التهجين)، بحيث يتم تكبير التهجين المحدد مقابل الارتباط غير المحدد (الخلفية)، كما يجب تقييم خصوصية الربط وبعد الكشف عن التحقيق في الأفلام والمقاطع يمكن إجراء دراسة نصفية للحمض النووي المسمى.

يمكن استخدام التهجين في الموقع للتأكيد بصريًا على عقم أنسجة الأسماك، حيث تتطلب هذه التقنية خبرة في تقطيع الأنسجة بالتبريد والتهجين في الموقع والفحص المجهري الفلوري، إذ يتم إصلاح الأنسجة التي تم فحصها بواسطة التهجين في الموقع بنسبة 4٪ لامتصاص العرق قبل التقطيع بالتبريد، وبالتالي فهي غير متاحة لمزيد من التحليل.

يمكن استخدام مزيج من مجسات (Eub338-I وEub338-II وEub338-II) المتاحة تجاريًا للكشف عن أنواع البكتيريا (eubacteria)، إذ أن التهجين في الموقع ليس حساسًا مثل (16S PCR)، ولكن يمكن أن يكون متساويًا أو أكثر حساسية من طلاء الملوثات على أجار غني بالمغذيات (الملاحظة الشخصية)، وله ميزة اكتشاف البكتيريا التي لا يمكن تربيتها.

تقنية التهجين الموضعي:

تُستخدم فحوصات (ISH) لتوطين المعلومات الجزيئية لأنسجة معينة أو أنواع خلايا أو صبغيات أو هياكل أخرى، كما يتطلب التفسير تقييم الإشارات ضمن سياق صرفي، وبالتالي في تأسيسه يتطلب تنسيق الفحص هذا حل وسط بين التوافر الكامل لهدف التهجين والحفاظ على إطار هيكلي يمكن التعرف عليه، (ISH) هي تقنية بيولوجية جزيئية تتبع مبادئ فحوصات تهجين الحمض النووي مع مطلب إضافي للحفاظ على السياق المورفولوجي.

يمكن تعيين مكونات اختبار (ISH) لمتغيرات ما قبل التحليل، وما بعد التحليل التي يجب فهمها وأخذها في الاعتبار في مراقبة جودة المختبر، كما هو الحال مع أي مقايسة فإن عينة مناسبة ممثلة للآفة قيد التحقيق لها أهمية قصوى، إذ إنه في العديد من البيئات السريرية يتم استخدام (ISH) بطريقة مماثلة لـ (IHC)، كاختبار مساعد بعد التقييم النسيجي الروتيني، حيث أن  هذا له ميزة السماح للأنسجة بتوجيه اختيار العينة الأكثر تمثيلا، ومع ذلك فإن القيد هو أن المعالجة الروتينية للأنسجة بعيدة كل البعد عن كونها موحدة.

تتضمن المسببات الجزيئية لعدد من الأمراض العصبية الدستورية والمكتسبة بما في ذلك التشوهات الخلقية والإعاقات الذهنية، وكذلك الأورام العصبية المركزية الأولية تغييرات عددية وهيكلية في الجينوم البشري الطبيعي ثنائي الصبغة، إذ تعتبر تقنية التهجين الموضعي الفلوري (FISH) وتقنيات التهجين الجينومي المستندة إلى المصفوفات الدقيقة، والتي يطلق عليها بشكل جماعي تحليل المصفوفات الدقيقة للكروموسوم (CMA) مركزية ليس فقط في التشخيص السريري وإدارة المرضى، الذين يعانون من هذه الأمراض، ولكن أيضًا في الجهود البحثية.

أصبح استخدام FISH لاكتشاف وتوصيف التشوهات العددية والهيكلية شائعًا في المختبرات السريرية خلال التسعينيات، حيث تسمح هذه التقنية بالتخيل المباشر لتسلسل الحمض النووي داخل الخلايا الفردية في الموقع باستخدام الفحص المجهري الفلوري، وهو يقوم على التهجين التكميلي لتحقيقات الحمض النووي إلى تسلسل مستهدف أو مجموعة متواليات داخل الجينوم، إذ يمكن تسمية هذه المجسات مباشرة بالفلوروفور (FISH المباشر) أو بدلاً من ذلك وصفها بالنيوكليوتيدات المترافقة بالبيوتين أو الديجوكسيجينين واكتشافها باستخدام الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت التي تستهدف اتحاد النيوكليوتيدات (FISH غير المباشر).

يمكن أيضًا استخدام التهجين اللوني في الموقع (CISH) بدلاً من أنظمة الكشف عن الفلورسنت، حيث غالبًا ما تُستخدم تحقيقات التسلسل المتكرر في تعداد الكروموسومات، في حين تُستخدم مجسات التسلسل الفريدة بشكل أكثر شيوعًا لتحديد تغييرات رقم النسخ في موضع معين، ولتوصيف إعادة ترتيب الكروموسوم المحدد بواسطة التنميط النووي التقليدي أو الجزيئي أو لتحديد إعادة ترتيب مكتسبة متكررة معينة مثل الذي يظهر في جميع مرضى ابيضاض الدم النقي المزمن تقريبًا، حيث يتم تهجين الدهانات الكروموسومية التي تتكون من العديد من مجسات التسلسل الفريدة المتداخلة والمتجاورة على طول الكروموسوم ذي الصلة، بحيث يبدو وكأنه مطلي، حيث تتوفر هذه المجسات لكل من 24 كروموسومًا بشريًا وتستخدم عادةً لوصف عمليات إعادة ترتيب الكروموسومات الهيكلية.

يمكن أن يكون (ISH) أداة قوية لدراسة التعبير الجيني وتوزيعه على المستوى الخلوي، في حين أن هناك عددًا من أوجه التشابه بين (IHC و ISH)، وفي الواقع تكمل الطريقتان بعضهما البعض، وهناك بعض الخطر في الإفراط في توضيح أوجه التشابه بين التقنيتين؛ لأن متطلبات الكاشف والخبرة الفنية لكل منهما هي مختلف تماما، إذ يعد فهم المبادئ التي تقوم عليها كل طريقة أمرًا ضروريًا “لحل المشكلات” في الإجراءات وتفسير النتائج.

من الواضح أنه يمكن الحصول على معظم المعلومات المتعلقة بالجين ومنتجاته البروتينية إذا تم تنفيذ كل من (IHC و ISH)، كما يمكن الحصول على مجموعة متنوعة من الأنماط المختلفة إذا تم تنفيذ كل من (IHC و ISH).