تقنية التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)): هي تقنية تُستخدم في تضخيم الحمض النووي باستخدام أنبوب أحادي عند درجة حرارة ثابتة، وهي تقنية تتشابه مع تقنية PCR في استخدام الحمض النووي، ولكنها تختلف في طريقة عملها، وتوفر هذه التقنية نتائج اختبار دقيقة وسريعة في الكشف عن مسببات أمراض معينة من البكتيريا وغيرها، والتي تتسبب في التهاب السحايا والانفلونزا.
خصائص تقنية LAMP
تمتلك تقنية LAMP العديد من الخصائص، وهذه الخصائص هي:
- إن تقنية LAMP هي طريقة يتم فيها تضخيم الحمض النووي للعينات المعقدة مثل عينة الدم عند درجة حرارة ثابتة.
- يمكن استخدام تقنية LAMP كطريقة فحص بسيط في الميدان أو في نقطة الرعاية من قبل الأطباء.
- يُستخدم في تقنية LAMP حرارة متساوية، مما يلغي الحاجة إلى أجهزة التدوير الحرارية باهظة الثمن، وبهذا فهي طريقة مفيدة لتشخيص الأمراض المعدية في البلدان الفقيرة والنامية.
- تمكن تقنية LAMP الباحثين من اختبار عينة واحدة أو أكثر بأيدٍ قليلة في الوقت المناسب، مما يساعد على تقليل الوقت اللازم للحصول على النتائج، كما تمكن هذه التقنية من إضافة عوامل لجعل التعرف على مسببات الأمراض أكثر بساطة، فقد تم استخدام صبغة المؤشر المعدني وأحمر الفينول واستخدام الهاتف الذكي والعين المجردة لتحليل النتائج.
- تتشابه تقنية LAMP مع تقنية PCR، فهي تستخدم الحمض النووي في تشخيص مسببات الأمراض، ولكنها تستخدم التضخيم المتساوي للحمض النووي عند درجة حرارة ثابتة، ولا تتطلب جهاز تدوير حراري، بعكس تقنية PCR التي تتطلب سلسلة من الخطوات ودرجات حرارة مختلفة.
- إن تقنية LAMP تُعطي نتائج سريعة ودقيقة، وتكشف عن مسببات الأمراض المتشابهة في أو نوعها أو تركيبها، وفي تسببها للمرض نفسه، ولكنها تختلف في آلية أو طريقة تسببها لذلك لمرض.
- تكشف تقنية LAMP عن العديد من الأمراض المعدية مثل فيروس زيكا والسل والملاريا وفيروس كورونا (SARS-CoV-2) في المناطق النامية.
- تكشف تقنية عن العديد من مسببات الأمراض مثل المثقبيات السوطية (التريبانوسوما) والديدان الفيلارية مثل ديدان اللوائيات والديدان البروجية والديدان الفخرية.
- تكشف تقنية LAMP عن التهاب السحايا والانفلونزا، فهي تكشف عن المجموعات المصلية للمكورات السحائية A و B و C و W و X و Y، وكذلك الأنماط المصلية لإنفلونزا المستدمية a و b و c و d و e و f.
مبدأ عمل تقنية LAMP
تتم تقنية على النحو الآتي:
- يتم تضخيم التسلسل المستهدف من الحمض النووي عند درجة حرارة ثابتة من 60-65 درجة مئوية، وذلك باستخدام مجموعتين أو ثلاث مجموعات من البادئات ( primers) والبوليميراز(polymerase )، مع عمل إزاحة لسلسلة الحمض النووي، وعمل نسخ متماثلة.
- ملاحظة: يمكن استخدام 4 بادئات مختلفة، وذلك لتضخيم 6 مناطق متميزة على الجين المستهدف في الحمض النووي، كما يمكن لزوج إضافي من البادئات الحلقية تسريع التفاعل بشكل أكبر.
- إن كمية الحمض النووي المنتجة في تقنية LAMP أعلى بكثير من التضخيم المعتمد على تقنية PCR.
- يمكن الكشف عن كمية التضخيم عن طريق القياس الضوئي، وقياس التعكر الناتج عن ترسب بيروفوسفات المغنيسيوم في المحلول كمنتج ثانوي للتضخيم.
- يمكن متابعة التفاعل في الوقت الفعلي إما عن طريق قياس التعكر، أو عن طريق التألق باستخدام الأصباغ البينية، كما يمكن استخدام الأصباغ مثل SYBR green لإنشاء تغيير مرئي للون يمكن رؤيته بالعين المجردة دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن، فتدخل جزيئات الصبغة في الحمض النووي.
- يمكن الكشف داخل الأنبوب عن تضخيم الحمض النووي LAMP باستخدام مركب الفلورسين (كالسين) المحمل بالمنغنيز، والذي يبدأ في التألق عند تعقيد المنغنيز بواسطة البيروفوسفات أثناء تكوين الحمض النووي في المختبر.
- يمكن الكشف البصري عن أمبليكونات LAMP بالعين المجردة عن طريق تأكسدها مع الحمض النووي المرتبط بالذهب التكميلي، وفيمنع ذلك تغير اللون الأحمر الطبيعي إلى الأزرق الأرجواني.
عيوب تقنية LAMP
- تعد تقنية LAMP أقل استخداماً من تقنية PCR، لأنها طريقة تشخيص أو كشف، وليست طريقة مفيدة في الاستنساخ، أو في العديد من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية الأخرى التي يتم يمكن فيها استخدام تقنية PCR.
- من الصعب في تقنية LAMP تصميم مجموعات أولية من الحمض النووي يمكن رؤيتها بالعين؛ وذلك لأن هذه التقنية تستخدم أربعة أو ستة بادئات التي بدورها تستهدف ست أو ثمانية مناطق صغيرة من الجينوم.
تقنية RT-LAMP
ما هي تقنية RT-LAMP
- التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة النسخ العكسي (RT-LAMP): هي طريقة واحدة لتضخيم الحمض النووي لمضاعفة متواليات معينة من الحمض النووي الريبي RNA، والتي يتم استخدامها لتشخيص الأمراض المعدية التي تسببها فيروسات الحمض النووي الريبي RNA، أي أنها تجمع بين اكتشاف الحمض النووي كما في تقنية LAMP والنسخ العكسي(Reverse transcription)، مما يجعل الحمض النووي DNA التكميلي (cDNA) مركب من الحمض النووي الريبي (RNA) قبل البدء بالتفاعل، ويتم إجراء هذه التقنية أيضاً عند عند درجة حرارة ثابتة بين 60 و 65 درجة مئوية.
استخدامات تقنية RT-LAMP
تُستخدم تقنية RT-LAMP في:
- يتم استخدام تقنية RT-LAMP في الكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي مثل فيروس SARS-CoV-2 وفيروس إيبولا.
- يتم استخدام تقنية RT-LAMP لاختبار وجود عينات RNA محددة من الفيروسات، وذلك من أجل تسلسل معين لفيروس ما، ويتم ذلك عن طريق مقارنة التسلسلات بقاعدة بيانات خارجية كبيرة من المراجع.
- يتم استخدام تقنية RT-LAMP في علم الأمصال الشرعي وسوائل الجسم.
كيفية عمل تقنية RT-LAMP
يتم عمل تقنية RT-LAMP بثلاثة خطوات رئيسية هي:
- النسخ العكسي: يبدأ إجراء RT-LAMP بتحويل الحمض النووي DNA، ويتم إجراء هذا التحويل عن طريق إنزيم النسخ العكسي، وهو إنزيم مشتق من الفيروسات الراجعة (retroviruses) القادرة على إجراء مثل هذا التحويل، ويسمى الحمض النووي الناتج من عملية التحويل والمشتق من الحمض النووي الريبي بالحمض النووي التكميلي، ويتم استخدام F3 primer لبناء سلسلة أحادية من نسخ الحمض النووي، ثم يرتبط F3 primer، ويزيل النسخة التي تم إنشاؤها مسبقاً.
- التضخيم: يرتبط BIP primer بالطرف الآخر من الخيط الفردي، ويبني حبلاً تكميلياً بواسطة Bst DNA polymerase، مما يجعل DNA مزدوج الشريطة، ثم يرتبط F3 primer وتتم إزالة جزيء الحمض النووي المفرد الذي تم إنشاؤه حديثاً، والذي يحتوي على بنية مثنية النهايات وترتبط ذاتياً وتشكل حلقتين، ثم يستمر بوليميريز الحمض النووي والبادئات FIP أو BIP في تضخيم الشريط ويتم تمديد منتج تفاعل LAMP، ويمكن أن تبدأ هذه الدورة من الجانب الأمامي أو الخلفي للخيط باستخدام البادئات المناسبة، ثم يخضع الشريط لتكوين حمض نووي ذاتي التحضير أثناء مرحلة الاستطالة في عملية التضخيم، وتحدث عملية التضخيم في أقل من ساعة عند درجة حرارة بين 60 و 65 درجة مئوية.
- قراءة النتائج: تكون قراءة نتائج تقنية RT-LAMP عن طريق القياس اللوني، ويعتمد ذلك على قياس درجة الحموضة أو أيونات المغنيسيوم، تؤدي عملية التضخيم إلى انخفاض درجة الحموضة وانخفاض مستويات المغنيسيوم، ويمكن ملاحظة ذلك من الفينول الأحمر للأس الهيدروجيني، والأزرق الهيدروكسينافثول (HNB) للمغنيسيوم، ويمكن استخدام عامل تلوين داخلي للحمض النووي مثل SYBR Green I.
